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(無題) 削除/引用 No.85-42 - 2011/03/10 (木) 13:08:51 - B 教科書や参考書に書いてあるトラブルシューティング、また、ここで皆様に教えていただいた方法も試したのですが、結局スメアのままでした。 なので、先生に相談してPrimerを再設計して、PCRにかけたところあっさりと出ました。 条件というよりは最初のPrimerの設計があまり良くなかったみたいです…。 皆様、ご指導、ご教授ありがとうございました。今回、学んだことをほかの実験にも活かせるように頑張っていきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.85-41 - 2011/03/08 (火) 11:27:41 - おお あれ、プライマーの量をへらすと書いたと思ったが、、、みあたらないので追加します。

(無題) 削除/引用 No.85-40 - 2011/03/08 (火) 06:51:43 - おお 随分続いていますので、書き込みを全部把握してませんが、条件とうでできると思ったことを書いてみます。 違う酵素、バッファー添加物の検討。バッファーの組成が明らかになっているものであれば、その中にDMSO(-10%)、ベタイン(-1M)、フォルムアミド(使う人がいるが私は使わないので濃度については分からない5%ぐらいとおもうが)などが入ってなければ加えてみる。違うメーカーの酵素をかうと、酵素自身の違いやバッファー組成なども変わるので、結局はバッファーをいじったりしているようなもんだという認識はあります。 スメアー、ノンスペが目的のサイズより高い(長い)位置にくるとき。伸長反応をみじかくする。目的より短い位置にくるとき、伸長反応は長めに取る。 アニーリング温度はプライマーのTcは無視して一度バンドが消える所まで上げるようなつもりで幅広くトライする。私はアニーリング温度設定は面倒なのでタッチダウンでやる事がふえました。 ノンスペがある場合はプライマー濃度を下げることも、特異性を出すのに有利です。 スメアーな状態でノンスペがドミナントであればサイクル数を減らして見ることも選択しだと思います。スペシフィックが先に立ち上がってきている可能性があります。 ホットスタート(マシンをあらかじめ96度とかに設定しておきチーブを設置する)。 ゲノムがターゲットなら増幅されるフラグメントにない制限酵素で切断する事でノンスペをへらす。 さらに切ったあとその制限酵素で目的の配列を含むフラグメントの長さに匹敵する所を電気えいどうしゲルから抽出して、ターゲットの量とテンプレートの複雑性をさげる。サイズによってはスピンカラムなど利用してもいいかもしれません。 あまりやらないがアニーリングのステップの時間の延長。 テンプレートの量をへらす。ゲノムのPCRはテンプレートの量を入れ過ぎてかからないことがしばしばあります。10ngあれば十分です。1ngぐらいでも何とかなるかもしれません。 プライマーが個体差などでマッチしてない可能性を考える。これはプライマーを変えるしかないです。

(無題) 削除/引用 No.85-39 - 2011/03/07 (月) 13:13:18 - ンンノ >やっぱりPrimerの再設計も考えた方が良さそうですよね。問題は、Primerに原因があるのか、僕の腕にあるのかというところなんですが。個人的には、半々くらいだと思っていますが、先生は腕のせいじゃないとは言ってくださっているのですが…。 おそらく、ピペットチップの先につく液量が多くて鋳型液とか酵素液を少し多 めにとってしまうとかの個人差のレベルで上手くいったり失敗してるんじゃ ないかと思います。 そういう要素が結果を左右するようならば、条件が十分に最適化されてない ということになります。 経験ではダメなプライマーは頑張っても徒労に終わることが多いような気がします。 今時の酵素液は精製度の低いDNAでも上手く行くようなので、そういう事も含め て新しいPCRプライマーの設計と条件検討のお伺いを立ててみたらいいんじゃ ないでしょうか。 ジェノタイピングが予定通り進まないと、もっと重要な実験がくめないでしょうし。

(無題) 削除/引用 No.85-38 - 2011/03/07 (月) 10:49:45 - B >Boston-Pullman様 > 条件検討を怠っているとは言わないまでも、ジェノタイピングが研究において、どれだけ重要であるかを理解していたら、、、。地味な操作に惑わされている気がします。 > 他のラボから違う酵素、バッファーを借りてやってみては？ あまりほかのラボと交流がないので、やりにくい気もします。というか、勝手にやるわけにはいかないので、先生に相談してみます。 > ami様 > そうかも、とも思うんですが、ラボの中ですら再現できないことがある、なんて状態をそのまま、ってのもどうかと思うんです僕は。ラボの中で再現できない、いわんや他のラボをや、って感じで。せめてラボの中っていう、比較的均一な条件のなかではかちっと再現できる条件で世に出せと。 > でも初心者が言うと角立つ。 プロトコルは僕が付いていた先輩（もう卒業されましたが…）と先生が来る前にボスが作ったものらしいので、大きく変更するしにくいというのはありますが、幸いにも先生も先輩も、自分が出せる条件を探そうと言ってくれているので、検討してみます。Primerの再設計も含めて。 > こういうのは、、、条件が十分検討されているとは言いがたいかと、、、もっとかかる別の条件を探します、私なら。 先生も言っていました。ボスが考えたプロトコルじゃなければ、文句もいいやすいのに、とおっしゃってました。 > ンンノ様 やっぱりPrimerの再設計も考えた方が良さそうですよね。問題は、Primerに原因があるのか、僕の腕にあるのかというところなんですが。個人的には、半々くらいだと思っていますが、先生は腕のせいじゃないとは言ってくださっているのですが…。

(無題) 削除/引用 No.85-37 - 2011/03/07 (月) 04:20:47 - Boston-Pullman 条件検討を怠っているとは言わないまでも、ジェノタイピングが研究において、どれだけ重要であるかを理解していたら、、、。地味な操作に惑わされている気がします。 他のラボから違う酵素、バッファーを借りてやってみては？

(無題) 削除/引用 No.85-36 - 2011/03/06 (日) 19:51:49 - ami > 私もそう思いましたが、ラボの中で初心者扱いされてる人が勝手なことすると 人間関係が悪くなるかもね。 そうかも、とも思うんですが、ラボの中ですら再現できないことがある、なんて状態をそのまま、ってのもどうかと思うんです僕は。ラボの中で再現できない、いわんや他のラボをや、って感じで。せめてラボの中っていう、比較的均一な条件のなかではかちっと再現できる条件で世に出せと。 でも初心者が言うと角立つ。

(無題) 削除/引用 No.85-35 - 2011/03/06 (日) 19:47:00 - ンンノ 10年くらいの前の論文で使われてた配列のプライマーで実験しようとしたこと があります。 4〜500bpくらいの安易なゲノムPCRだと思ったのですが、最近の酵素では長い 非特異産物が出来てシーケンス反応の鋳型にならなかった。 時間を短くしたりもして条件検討しましたが、結局あきらめました。 参照した論文で使われてた旧い酵素を買うよりプライマーの合成のほうが 安かったので、再設計しました。 PrimerBLASTで新しく作ったプライマーは1kbp以上の産物だけど一発で綺麗に 増えて、目的達成。 PrimerBLASTはゲノム配列情報を参照して非特異産物の危険性まで加味してく れるようですね。 >[Re:34] amiさんは書きました : > > 初心者には出にくい > > こういうのは、、、条件が十分検討されているとは言いがたいかと、、、もっとかかる別の条件を探します、私なら。 私もそう思いましたが、ラボの中で初心者扱いされてる人が勝手なことすると 人間関係が悪くなるかもね。

初心者には出にくい 削除/引用 No.85-34 - 2011/03/06 (日) 17:56:22 - ami > 初心者には出にくい こういうのは、、、条件が十分検討されているとは言いがたいかと、、、もっとかかる別の条件を探します、私なら。

(無題) 削除/引用 No.85-33 - 2011/03/05 (土) 10:49:47 - B >123様 返信ありがとうございます。 > 目的遺伝子のプラスミドをテンプレートとした反応は、毎回やっているのでしょうか？ いえ、やっていないです。というか、今、ラボにはそのプラスミド自体がないと思います。 >Boston-Pullman様 > なら条件が良くないだけです。プライマーの配列によって要求されるマグネシウムイオン濃度は異なります。EpicentreのbufferCもしくはDで対応できるかと思います。 返信ありがとうございます。やっぱりそうなんでしょうか？僕がこのラボに来る前からあったプロトコルで基本的には出るそうなのですが…。初心者には出にくいとは言われていますが…。 >[Re:29] ンンノさんは書きました : > > 昔のPCR酵素で最適化されたプライマーは、最近の高性能な酵素では上手く > 増えないことがあります。特にゲノムDNAのPCRで。 > 伸長反応が速すぎて長いのが出来て、プライマーの特異性が低い場合に > ターゲット意外でプライミングしてしまうのが原因だと思ってます。 返信ありがとうございます。伸長時間を短くすればよいってことでしょうか？ > 都市伝説様 > あらかたすぐに思いつく点は出たと思いますので、つまらないことを書き込ませてもらいます。気に入らない方は読み飛ばしてください。 > > だいぶ昔にこのフォーラムでも囁かれていましたが > PCRが上手くいかなくなった時、実験を行う場所を変えると上手くいく > というのが都市伝説としてあります。 > 実際、私もgenotypingでバンドがでなくなったことがありますが、 > 場所を変えることでなぜかバンドが出るようになったことはあります。 もしかしたら作業している実験台にDNaseが付着しているかもしれないという可能性も考えて、別の場所をクリーンにしてからやってみたことはあるのですが、やはりスメアになりました。機械も代えてやってみたこともあるのですが…。 > あとはピペットがコンタミしている可能性はどうでしょうか。 その可能性はないと思います。先生が見ている傍で先生のピペットを使ってやったこともあるので。結果は駄目でしたが。

ポジコン 削除/引用 No.85-32 - 2011/03/04 (金) 23:02:48 - 123 目的遺伝子のプラスミドをテンプレートとした反応は、毎回やっているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.85-30 - 2011/03/04 (金) 20:43:46 - Boston-Pullman >ただ、先輩や先生がやって、全部スメアになったこともあります。 なら条件が良くないだけです。プライマーの配列によって要求されるマグネシウムイオン濃度は異なります。EpicentreのbufferCもしくはDで対応できるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.85-29 - 2011/03/03 (木) 18:31:29 - ンンノ 連投で失礼します。 昔のPCR酵素で最適化されたプライマーは、最近の高性能な酵素では上手く 増えないことがあります。特にゲノムDNAのPCRで。 伸長反応が速すぎて長いのが出来て、プライマーの特異性が低い場合に ターゲット意外でプライミングしてしまうのが原因だと思ってます。

(無題) 削除/引用 No.85-28 - 2011/03/03 (木) 18:27:12 - ンンノ PCRの機械を換えたら増えなくなったとか、装置を置く場所を換えたらとか、 反応チューブを立てる場所を換えたら、そういうことなら私もあります。

(無題) 削除/引用 No.85-27 - 2011/03/03 (木) 18:20:23 - 都市伝説 あらかたすぐに思いつく点は出たと思いますので、つまらないことを書き込ませてもらいます。気に入らない方は読み飛ばしてください。 だいぶ昔にこのフォーラムでも囁かれていましたが PCRが上手くいかなくなった時、実験を行う場所を変えると上手くいく というのが都市伝説としてあります。 実際、私もgenotypingでバンドがでなくなったことがありますが、 場所を変えることでなぜかバンドが出るようになったことはあります。 （信じてはもらえませんが・・・） あとはピペットがコンタミしている可能性はどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.85-26 - 2011/03/03 (木) 16:58:55 - B >mom-a様 > > 長くなってきたせいもありますが、今ひとつ何が出来ていて何ができていないのかわかりにくいような… 出来る人と同じサンプル、プロトコルでやると僕だけがスメアになるという状況です。ただ、先輩や先生がやって、全部スメアになったこともあります。試薬のコンタミも疑ったのですが、新しいものに変えても同じ結果となりました。 > あなたのサンプルを先輩にやってもらったのはいつのことでしょう？その後、サンプルに何かが起こって分解してしまった、などの可能性は？ 先輩にやってもらったのは、ＤＮＡを抽出した次の日です。ＤＮＡはＰＣＲに使うとき以外は、４℃にて保存しています。また、先輩の操作を見てすぐに自分も行ったので分解した可能性は少ないと思うのですが……。 > 先生のお言葉からは条件が微妙だという（ちょっとしたことで上手くいったりいかなかったり？）可能性があるのでしょうか？もう一度PCRの条件検討（アニーリング温度など）をやり直すという可能性は？ はい、そういうことだと思います。なので、より出やすい条件も探ることになっています。アニーリング温度なども変えてはいるのですが…。バンドが出ないのではなく、完全に滝のようなスメアになってしまっています。 > 「別の系統のマウスのgenotypingは出来る」とは、あなた自身がやって出来た、ということでしょうか？ はい、自分でやりました。 電気泳動したときは他の人がＰＣＲにかけて出たものを借りてやったところ、自分がＰＣＲにかけた物はスメアになり、それ以外はちゃんとバンドが出たので、電気泳動には問題がないように思います。

(無題) 削除/引用 No.85-25 - 2011/03/03 (木) 10:26:12 - mom-a >ＫＯＤ　ＦＸを使っております。このＢｕｆｆｅｒには、Ｍｇも含まれているので、入れる必要はないはずですよね？ そのとおりです。2xBuffer、dNTPsおよび酵素量は指定どおりになっていますね。 長くなってきたせいもありますが、今ひとつ何が出来ていて何ができていないのかわかりにくいような… >僕が、ＤＮＡ抽出したものも先輩にもやっていただき、上手くいっていました。 >先生が言うには、ちょっと何かがずれると出にくい条件でやっているのかもしれないと >僕が使っているマウスのgenotypingは出ないのですが、まったく別の系統のマウスのgenotypingは出来るので、操作の問題だけではない気もするのですが…。 あなたのサンプルを先輩にやってもらったのはいつのことでしょう？その後、サンプルに何かが起こって分解してしまった、などの可能性は？ 先生のお言葉からは条件が微妙だという（ちょっとしたことで上手くいったりいかなかったり？）可能性があるのでしょうか？もう一度PCRの条件検討（アニーリング温度など）をやり直すという可能性は？ 「別の系統のマウスのgenotypingは出来る」とは、あなた自身がやって出来た、ということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.85-24 - 2011/03/02 (水) 19:37:02 - B >aaaa様 すみません。普段からラボでＫＯＤとだけしか、みんな言っていなかったので、シリーズを書いていませんでした。ＫＯＤ　ＦＸを使っております。このＢｕｆｆｅｒには、Ｍｇも含まれているので、入れる必要はないはずですよね？ラボの先輩も先生も同じなので、間違いないと思うのですが。

(無題) 削除/引用 No.85-23 - 2011/03/02 (水) 19:18:34 - ~ >MgSO4ではなく、MgCl2でした。 どっちでもいいですけど、2xのKOD bufferに入っているのでは。

(無題) 削除/引用 No.85-22 - 2011/03/02 (水) 19:08:40 - aaaa すみません。 MgSO4ではなく、MgCl2でした。

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