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(無題) 削除/引用 No.838-7 - 2011/08/27 (土) 15:09:25 - YFP TS様 コメントありがとうございました。 ＞欠損変異体と野生型のフュージョンタンパクのコンフォメーションの違いか何かの都合で、蛍光強度に影響が出ている様な気がします。 目的タンパク質の発現量を判断する上では、蛍光強度よりWesternの方がベターだとご意見が多いようですね。参考にさせていただきます。 ＞解決策というわけではないですが、Anti-目的タンパク質でWBやったらどうなったのでしょうか？　認識するエピトープが変異の辺りでなければ、使えますよね。ちょっとした判断材料として、どうなるのかな、と思う程度ですが。 大変有効な手段だと思っているのですが、現在、手元にAnti-目的タンパク質がなく、実験できておりません。

(無題) 削除/引用 No.838-6 - 2011/08/27 (土) 14:49:31 - TS >変異によって、抗体の結合量が変化する可能性があるかどうか、このトピで質問させていただいています。 WBの話ですよね。anti-YFPを用いているし、変性させててるから、可能性は低いんじゃ。anti-目的タンパク質、なら話は別ですが。 欠損変異体と野生型のフュージョンタンパクのコンフォメーションの違いか何かの都合で、蛍光強度に影響が出ている様な気がします。 解決策というわけではないですが、Anti-目的タンパク質でWBやったらどうなったのでしょうか？　認識するエピトープが変異の辺りでなければ、使えますよね。ちょっとした判断材料として、どうなるのかな、と思う程度ですが。

(無題) 削除/引用 No.838-5 - 2011/08/27 (土) 13:14:54 - YFP いろいろな貴重なご意見ありがとうございました。 ab様 ＞実際の発現量が低くても、YFPが凝集して強い蛍光を発するようになって、＞FACSや共焦点では見かけ上発現が強く見えている気がします。 YFP自体が凝集することは経験していましたが、それによって、蛍光強度が強くなることは知りませんでした。これについて、良い文献などはありますか？ TK-1様 ＞なぜ、”何らかの立体障害により、YFPと抗体の相互作用が、野生型と変異＞型で異なったため、このような現象が生じた可能性はあるのでしょう ＞か？”ということにたどり着くのかわかりませんが、私なら変異によって＞conformationがかわって蛍光強度がかわったと考えます。 タンパク質の立体構造によって、抗体の結合が変化することが念頭にありましたので、一応、その解釈をのせました。ただ、SDSで変性したタンパク質を 泳動していますので、その可能性は低いと思っていました。 ＞ところでこの実験で、何が見たいのかもう少し説明した方がいいと思いま＞す。 野生型で観察されるfunctionが、欠損変異体では消失するので、これが単に発現量の差を反映しているのではないということを示したいと思っています。 ＞野生型のfusionはタグなしの野生型と同様にfunctionalなんですか？ 共にfunctionalです。 モモ様 ＞ウエスタンは何を認識しているんでしょうか？ YFPを認識しています。 ＞変異により認識が弱い可能性はないんですか？ 変異によって、抗体の結合量が変化する可能性があるかどうか、このトピで質問させていただいています。 言い換えれば、変異によって、標的タンパク質の発現が減少したのか、もしくは、標的タンパク質の発現量は同じにも関らず、変異によって、抗体の結合量が変化したのか、この２つの可能性を考えています。

(無題) 削除/引用 No.838-4 - 2011/08/27 (土) 09:46:33 - モモ ウエスタンは何を認識しているんでしょうか？ 変異により認識が弱い可能性はないんですか？

(無題) 削除/引用 No.838-3 - 2011/08/27 (土) 04:02:40 - TK-1 FACS&confocal: 蛍光量の測定 Western:タンパク量の測定 変異体と言えど違う蛋白です。YFP単独、YFP-野生型fusion、YFP-変異型fusionで一分子辺りYFPの蛍光強度が同じであれば疑問は理解できます。 なぜ、”何らかの立体障害により、YFPと抗体の相互作用が、野生型と変異型で異なったため、このような現象が生じた可能性はあるのでしょうか？”ということにたどり着くのかわかりませんが、私なら変異によってconformationがかわって蛍光強度がかわったと考えます。 ところでこの実験で、何が見たいのかもう少し説明した方がいいと思います。distribution? stability? 抗体がないからYFP-fusionを作ってみた？野生型のfusionはタグなしの野生型と同様にfunctionalなんですか？

(無題) 削除/引用 No.838-2 - 2011/08/27 (土) 02:17:02 - ab たしか元々のGFPは多量体を形成して蛍光が増強される（単量体だと蛍光がでない？）と記憶しているのですが、YFPはGFPの変異体だったと思うので、目的のタンパク質の欠損変異体にもし凝集傾向があれば、YFPの蛍光も増強されると思います。 つまり、実際の発現量が低くても、YFPが凝集して強い蛍光を発するようになって、FACSや共焦点では見かけ上発現が強く見えている気がします。 YFPの抗体を用いてFACSや共焦点で（もちろんYFPとは異なる色調の蛍光で）観察するとどうなるでしょうか？ YFPの蛍光が単量体でも多量体でも変わらないなら関係ないですが…

アッセイ系による結果の相違 削除/引用 No.838-1 - 2011/08/27 (土) 00:37:07 - YFP いつも勉強させていただいています。 現在、野生型及び欠損変異体の細胞内C末端にYFPを融合させたタンパク質の解析を行っています。 FACSや共焦点レーザー顕微鏡を使った結果では(YFPの蛍光強度を指標)、明らかに欠損変異体の方が、野生型よりも強く発現しています。 しかし、Western blotで解析すると、野生型の方が変異型よりも強く発現しているという、先の結果と相反する結果が得られました。 （LysateはRIPAで調製し、タンパク質がアグルため、ボイルは行っていません。） なお、YFP単独のバンド(約27kDa)は、検出されていません。 何らかの立体障害により、YFPと抗体の相互作用が、野生型と変異型で異なったため、このような現象が生じた可能性はあるのでしょうか？ 皆様のご経験・ご意見をお聞かせいただけると助かります。 （タグを変えて検討するといった議論は、今回はなしでお願いします） また、似たような結果が載っている論文がありましたら、ご紹介お願いいたします。

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