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(無題) 削除/引用 No.820-11 - 2011/08/27 (土) 10:58:32 - むう 現状で精製サンプルに少しは見えているのなら、ゲルの染色剤を一般的なEtBrからSYBR greenのような高感度蛍光色素に変えるのが一番簡便かと思います。APさん提案のDIG標識法に比べれば劣りますが、10倍程度は感度を上げることが出来るはずです。

(無題) 削除/引用 No.820-10 - 2011/08/26 (金) 20:46:09 - AP 最初から要点を要領よく説明してくれたらいいのに、、、、、 ポイントは、 ・収量はゼロではないが制限酵素消化パターンを調べるのに足りない。 ・多サンプルを扱うのでスケールアップで解決するのは避けたい。 ということですよね。先の質問に答えてもらっていないけれど、理論上もっと取れるはずという見込みはあるんでしょうか。miniprepだと今の収量で妥当ではないのですか？だとしたら、どんなに手技の工夫を頑張って収量を上げようとしても無理というものです。 別の攻め方としては、制限酵素消化したのちDNAの末端標識をして検出する手があると思います。例えば、少なくともひとつのAを含む5'突出末端を生じる酵素で消化した後、DIG-ｄUTPを含むdNTP mixとklenowを加え、末端をfill-upするときにDIG標識を取り込ませます。これをメンブレンにブロットして、anti-DIG抗体で検出します。この方法ならEtBrで見えないバンドも見えますし、分子量が小さくなるほど見えにくくなるということもなく、すべてのバンドが同じ強度で検出できます。

(無題) 削除/引用 No.820-9 - 2011/08/26 (金) 18:25:20 - nnn どのくらいの収量が必要なのかわかりませんが、 (Miniでやるってことは、そんなにいらないのでしょうが） キットを使わずにとってくればいいのではないでしょうか？ 以前、BACを使った時は、 http://bacpac.chori.org/bacpacmini.htm のプロトコールを使いました。 単に、P1、P2、P3（N3ではなく）で処理し、 遠心してペレットを除いて、上清を取り、 イソプロ沈、エタ沈で回収です。 目的によっては、これでいいと思うのですが。 あと、QIAGENのminiprepのキット、と言われても、 たしか、細かく分けると数種類あり、 大きなサイズのプラスミドでも、かろうじて溶出できるキットと、 プロトコールには書いてあっても、実際には溶出が難しいキットもあります。

(無題) 削除/引用 No.820-8 - 2011/08/26 (金) 17:44:58 - ~ 根本的に操作を間違えている可能性が否定されていないので、 スケールアップの前にこれまでのデータを確認したほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.820-7 - 2011/08/26 (金) 17:25:30 - 内野手 培地を変えたらどうなるかとか、どこかに改善の余地はないかとか色々考えて試すよりも、スケールを大きくした方が速いと思います

(無題) 削除/引用 No.820-6 - 2011/08/26 (金) 16:04:50 - R LB培地を増やして、ひたすらミニでとりまくり。 ちりも積もれば山となる。

(無題) 削除/引用 No.820-5 - 2011/08/26 (金) 16:02:15 - ~ まずは#3の質問に答えては？ 0.1ug/mL(LB培地)も取れないようなBACはありますし、 悪いのが収率なのか収量なのかが分かりません。 収”率”が低いだけならば、今の培養スケールで収”量”を増やせる余地があるかもしれませんが、 収率を100%を超えさせることは、現実的ではないと感じます。 また、培地をリッチなものにすることで、収量を上げることもできる場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.820-4 - 2011/08/26 (金) 15:18:37 - 5 largeサイズのものを標的にするときの、qiagenの注意通り行っています。 バクテリアが持っているプラスミドを比較するため、回収したプラスミドを制限酵素反応後、エタノール沈殿で濃縮してゲルで泳動しているのですがバンドを見ることができません。制限酵素反応前のものを泳動するとバンドを見ることができます。制限酵素反応すると当然、バンドが切れて薄くなりますので収量を上げなければと思っているのですがなかなかうまくいきません。 内野手さんの書かれているとおりmidiやlarge prepやlarge constructをするしかないのでしょうか？手元にあるのがminiprepですのでなるべくmidiなどは使いたくないと思っています。キットを使用しない方法としてmolecular cloningのプロトコールを確認するとlargeサイズのプラスミドの抽出は1サンプル当たりの培養液の量が多いので、多検体の処理をするときは現実的ではないなと感じました。何か良い方法をご存知でしたらお願いします。

(無題) 削除/引用 No.820-3 - 2011/08/24 (水) 23:17:52 - AP 収量が悪いって、実際どれくらいなんでしょうか？ ベクターの骨格は？ 100 kbを超えるようなベクター（BACなんか）は、安定性のためにコピー数が少なくなるような（一細胞1〜2コピーとか、30コピー程度とか）ベクター骨格になっているのが普通です。pUC（一細胞数百コピー）なんかのような収量がなくて当たり前なんですが。ベクター固有のコピー数を考えに入れてもなお収量が少ないですか？　Qiagenの説明書にはBACなどを扱う場合のプロトコールもついていますが、記載を確認済みですか?

(無題) 削除/引用 No.820-2 - 2011/08/24 (水) 18:53:14 - 内野手 midiなりlarge prepなりをやる

大きなサイズのプラスミド抽出 削除/引用 No.820-1 - 2011/08/24 (水) 17:53:02 - 5 100kbを超えるサイズのプラスミドを大腸菌からQiagenのキット(miniprep)で抽出していますが収量が悪く困っています。マニュアルに従い、最後の溶出は温めたバッファーで行っていますが収量が悪いです。何か方法があれば助言いただけると助かります。

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