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NP-40による細胞可溶化 トピック削除
No.814-TOPIC - 2011/08/23 (火) 11:53:41 - chisa
例えば0.5% NP-40で細胞を可溶化した場合（マンマルや昆虫細胞）、細胞はどこまで傷害を受けるのでしょうか？
恐らく、膜蛋白質などは可溶化してくると思われますが、その時、細胞膜はブチブチに破壊されるものなのでしょうか？
細胞質内のタンパク、核内のタンパクはどこに回収されるものなのでしょうか？

ご教授宜しくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.814-7 - 2011/08/26 (金) 06:05:03 - ここですか、ガラッ。
古典的な細胞分画では、純度の高いインタクトな核画分を得るときこのくらいかもう少し高い濃度のNP40　or トライトンx100を使う。ということは、核以外の比較的溶けやすい膜蛋白質、核膜の外側にくっついてる一部や細胞質の大部分の蛋白質は可溶化できるだろうが、大部分の核蛋白質とくにクロマチンやDNAに比較的安定にくっついた転写因子の可溶化はこの条件ではあまり期待出来ない。一部の細胞骨格系もたぶん難しいだろう（つまりこれらはまとめて沈殿に来る）この沈殿を高い塩濃度のbufferでけんだくすると、そういう蛋白質はそれなりに可溶化してくるが、全てではない。どうしても無理っぽいのはまあ変性してもやむをえないとということで最後SDS bufferとかureaとかで溶かす。単にウェスタンとかでみるなら核画分を直接とかしてもいい。大事な事は、こういうのは材料とか、条件でも変わるので、はじめから過去の論文をたよりにして、たぶんここに来るはずだからと判断せず、自分の実験では、自分のみたい蛋白質がどこに来るか、それぞれの画分をウェスタン等で自分でチェックする必要がある。

(無題) 削除/引用
No.814-5 - 2011/08/23 (火) 17:47:19 - たぶん
核内のタンパクはヒストン系はDNAにくっついて、そのNP40を含むバッファーがDNAを可溶化しないかぎり、抽出されません（のが多い）。
核内のタンパクで転写因子、制御因子系はほとんど抽出されてしまうのが多いと思います。

膜タンパク、骨格系タンパク 削除/引用
No.814-4 - 2011/08/23 (火) 16:36:54 - 歌謡化
骨格系や脂質とインタラクションするものがあるため、NP-40程度では細胞膜タンパク質は全て可溶化できません。SDSでも可溶化しにくいものも存在します。可溶化を議論するには、可溶化を調べる以外に方法はありません。遠心などを用いた分画には有効な方法ではありますが。
形態的な話であるならば、固定せずに界面活性剤で処理することは特別な処理なので、一般的な答え方はできません。
また、NP-40程度では多くの酵素活性が残っていることにも注意が必要です。

界面活性剤の濃度でCMCの計算値が有効なのは十分量溶液が存在する場合です。しかし、生化学実験ではしばしば、大量の細胞に少量のCMCぎりぎりの液で膜透過処理を行なう場合があります。十分量では可溶化できるタンパク質を残した状態の細胞ができます。目的の分子の可溶化とは区別が必要です。
教科書にはほとんど記載されないことですが、専門家にとっては常識です。論文でも省略されがちです。一般的な回答ができないこともあるからでしょうが、サイエンスの世界でも情報の共有はまだまだです。"Knowledge is power"と思い他人とは共有したくないのかもしれません。でもこのようなことはまともな人が実験をやればすぐに分かります。Chisaさんが求めている答えは、自ら実験したほうが早いと思います。たくさん実験をしましょう。

(無題) 削除/引用
No.814-2 - 2011/08/23 (火) 12:08:00 - むう
水風船に穴を開けるようなものです。不溶性成分と結合している場合などの特別な条件がなければ、外液と混ざって均一になります。

NP-40による細胞可溶化 削除/引用
No.814-1 - 2011/08/23 (火) 11:53:41 - chisa
例えば0.5% NP-40で細胞を可溶化した場合（マンマルや昆虫細胞）、細胞はどこまで傷害を受けるのでしょうか？
恐らく、膜蛋白質などは可溶化してくると思われますが、その時、細胞膜はブチブチに破壊されるものなのでしょうか？
細胞質内のタンパク、核内のタンパクはどこに回収されるものなのでしょうか？

ご教授宜しくお願いします。
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