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(無題) 削除/引用 No.798-3 - 2011/08/20 (土) 05:37:19 - azd まず飢餓有無、LPS濃度の検定ではなく、その抗体（及びWBの条件）がワークするか確認すべきかと思います。 LC3-IIの増加を見る為のポジコンの設定は通りすがりん様が仰っている方法が良いと思います。ただし、私はC2C12細胞を扱った事が有りませんが、濃度、細胞種によっては毒性が強すぎるかも知れません。2-3のタイムポイントと濃度を取った方がベターです。 BafAなら1-100nM、Leupeptin,Pepstatinなら1-100uM位が、私が扱っている細胞での使用濃度の範囲です。 starvationは効きにくい細胞種も有るように感じますがC2C12細胞ではどうなんでしょう？ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=21095008 を見るとかなりはっきりLC3-IIが増加しているようにも見えますが。 ただ文章を拝読するにLC3-Iすら検出できていないような感じですが、お使いの抗体は確かな物なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.798-2 - 2011/08/19 (金) 16:14:17 - 通りすがりん １．内部コントロール（βアクチンやGAPDH）などは検出できるのでしょうか。 これが確認できれば、ウエスタン解析のプロトコールは概ね正しいといえます。 ２.LC3B抗体が失活していないことは確認できますか。 オートファジープロセスの後半を止めるBafilomycinA1 24-48h培養や、リソソームインヒビター 24h-48h 培養でポジティブコントロールが作成できます。 羊土社から今月発売された「タンパク質分解系による生体防御」にオートファジーの評価方法が記載されています。

WBでのLCB検出 削除/引用 No.798-1 - 2011/08/19 (金) 15:28:17 - からあし 私は現在、C2C12細胞を用いてWBでのLCBの検出を行っています。 しかし、バンドすら確認出来ない状態でうまくいかないので 条件を再検討しようと考えています。 現在の条件は C2C12細胞 ・飢餓なし ・LPS100ng/mlで刺激後8h培養 ・1×SDS回収 です。 この条件を C2C12細胞 ・D-MEM無血清での飢餓2.5h ・LPS100ng/ml-1µg/mlの濃度ｺｰｽ ・LPS刺激後の培養時間のﾀｲﾑｺｰｽ ・RIPA bf.回収 にして再検討したいと考えています。 またWBでは引き続き 15％ゲル 膜転写45min で行おうと考えています。 LC3Bに詳しい皆さま、 これからの研究の参考にさせていただきたいので 私が再検討しようとしている条件へのご意見等よろしくお願いいたします。

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