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リン酸化PECAMの検出 削除/引用 No.796-13 - 2012/06/07 (木) 03:56:31 - Take1 遅レスですが解決しました． まず4G10（抗体）を新しい物に変更．買い直しました． これで露光10分でうっすらシグナルが出ました． あとはECLを高感度タイプの物に変更し，奇麗なバンドが出るようになりました． ありがとうございました．

(無題) 削除/引用 No.796-12 - 2011/08/21 (日) 23:54:02 - Take1 4G10-HRPに付属してきたポジコンでは、4時間のexposureでうっすらバンドが出ました。ブロッキングには2％BSA、最初の細胞洗浄にはTBSを使いました。また今回は時間がなく、一次抗体の反応は室温1時間にせざるを得ませんでした。 十分ではないとはいえ一応ポジコンのバンドがうっすら出たのでひとまずほっとしましたが、まだまだ試行錯誤が必要そうです。 confluentのPECAMからは全くでませんでした。本来ならば弱いリン酸化が検出されるはずなんですが。ポジコンの反応の弱さを考えると写らなくてもしょうがないのかもしれません。 今後は 1.4G10を使う。 2.O/Nで反応させる。 あとは製造元のMilliporeに条件を聞いてみるぐらいでしょうか？ 何かアドバイスがあればお聞かせください。

(無題) 削除/引用 No.796-11 - 2011/08/19 (金) 14:55:16 - kodamataro 気にしすぎかもしれませんが 緩衝液も説明書や論文に従った方が良いと思います。 私はＴＢＳＴを使っています。 (PBSのリン酸イオンはたぶん影響しないと思いますが、念のため・・・） >なんだかわからないものが一個入ってました。それがポジコンかもしれません。 おそらくそれがポジコンです。

(無題) 削除/引用 No.796-10 - 2011/08/19 (金) 14:18:45 - Take1 なるほど！！！ 確かに説明書には「superblockを使ってブロッキング云々」と書いてあった気がします。明日BSAでやってみます。 ポジコンは入ってなかったような。。。もう一回調べてみます。 でもなんだかわからないものが一個入ってました。それがポジコンかもしれません。 うまくかけませんが、ヤル気になってきました。もうちょっと頑張ってみます。結果を報告します。

(無題) 削除/引用 No.796-9 - 2011/08/19 (金) 13:24:28 - kodamataro スキムミルクはチロシンリン酸化抗体には向かないと下記書籍に書かれていたのを記憶しています。 http://www.yodosha.co.jp/book/9784897069197.html スキムミルク中にリン酸化チロシンが多量に含まれているためだったと思います。 抗体をスキムミルク/緩衝液で希釈しているのでしたら、ミルクに抗体がすべて吸着してしまったのでしょう。→　メンブレンに抗体が付かず、何も見えない 2%程度のBSAでやってみてください。ブロッキングも抗体の希釈も。 4G10抗体はミリポア経由（品番05-321）で購入すればポジコンが付いてくると思います。 質問者様はポジコンをお持ちですか？

(無題) 削除/引用 No.796-6 - 2011/08/19 (金) 13:03:48 - Take1 > このとき、他のタンパク質のリン酸化は、なにかしら見えるのですよね？　レーン全体を見たときに何も見えないとなると、抗体の活きに問題があるかもしれませんが。 なんにも出ないんです．whole cell lysateでなにがしかバンドが出ればと思ったのですが．抗体は買ったばっかりです．指定された温度で保存してます．もうなにがなんだか．．． > そうですか。熱による活性化もされていますよね。 IPしたあとlysis bufferで三回洗って，最後に上清を除いた後サンプルバッファーを入れて98℃5分間加熱処理，その後遠心して上清をサンプルとしています．この処理のことでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.796-5 - 2011/08/19 (金) 12:29:25 - TS ＞・本当にそのサンプルでのリン酸化が検出可能レベルなのか Whole cell lysateも別のレーンに流して見ているのですが，そっちもまったく反応なしです． このとき、他のタンパク質のリン酸化は、なにかしら見えるのですよね？　レーン全体を見たときに何も見えないとなると、抗体の活きに問題があるかもしれませんが。 ＞・100μg/0.5 mLって、少なめですね そうですか．．．．スライド２枚分を同条件で実験してまとめてサンプルにするのがいいですかね．どれくらいあれば十分といえるのでしょうか？ あ、これはただの一般的なプロトコルと比べてと言うことで、Total PECAMが十分量落ちてきていれば（anti-PECAMでかなりの強いシグナルが出る）、問題ないと思います。ちなみにわたしは、0.5-1mg/mLくらいでIPすることが多いです。（PECAMはやったことありませんが） ＞・脱リン酸化酵素阻害剤は、Lysis buffer, IP bufferに入れているか IP bufferはlysis bufferと同じものを使ってます．書き忘れましたがSodium Orthovanadateも入ってます そうですか。熱による活性化もされていますよね。

(無題) 削除/引用 No.796-4 - 2011/08/19 (金) 12:19:28 - Take1 TSさん 4G10はメジャーなようです． ・本当にそのサンプルでのリン酸化が検出可能レベルなのか Whole cell lysateも別のレーンに流して見ているのですが，そっちもまったく反応なしです． ・脱リン酸化酵素阻害剤は、Lysis buffer, IP bufferに入れているか IP bufferはlysis bufferと同じものを使ってます．書き忘れましたがSodium Orthovanadateも入ってます． ・100μg/0.5 mLって、少なめですね そうですか．．．．スライド２枚分を同条件で実験してまとめてサンプルにするのがいいですかね．どれくらいあれば十分といえるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.796-2 - 2011/08/19 (金) 12:11:05 - TS 抗リン酸化アミノ酸抗体による認識は、配列依存的です。 anti-pYは、pT, pSよりも性能がよいと思いますが、すべてのリン酸化チロシンを認識できる訳ではないと思います。 過去の論文で、その抗体が使われているのでしょうか。 （もちろんそれも当てになるかどうかはわかりませんが） 他に気になるところとして、 ・本当にそのサンプルでのリン酸化が検出可能レベルなのか ・脱リン酸化酵素阻害剤は、Lysis buffer, IP bufferに入れているか ・100μg/0.5 mLって、少なめですね

リン酸化PECAMの検出 削除/引用 No.796-1 - 2011/08/19 (金) 11:29:00 - Take1 HUVECを3inch×1.5inchのガラススライド上に培養し，PECAMのリン酸化を見るのがミッションなのですが，まったくバンドが出ません． １．cold PBSで３回洗浄． ２．leupeptin,PMSF,NaFなどが入ったlysis buffer200μLを添加，30秒待ってcell scraperでごしごしlysis bufferを回収．4℃で30分ローテーション．タンパク濃度調整． ３．PECAM-1抗体(C20)でIP. ４．電気泳動→転写 ５．anti-phospho-tyr抗体(4G10-HRP)で反応させ ６．化学発光で検出 ７．ストリップ ８．PECAM-1抗体(C20)で反応させ化学発光で検出 total-PECAM-1のバンドはきちんと出ます． 別のレーンにwhole cell lysateを流してますが，こっちもPECAMは出るんですが, (4G10-HRP)のほうはまったく出ません． ブロッキングには5%milk-TBSを使ってます． タンパク回収液のタンパク濃度は1000μg/mL程度です．それを100μg/0.5mLに調整してからIPしてます． 周囲に相談できる人がいないので，どなたかご教授をお願いします．

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