現在、大腸菌とAlpha Proteobacteriaの細菌とのシャトルベクター構築を行なっています。
Alpha Proteobacteriaからプラスミド（この菌はプラスミドを６つ持っているので、その混合物です）を抽出して平滑末端が出来る制限酵素で切断後、SmaI/CIP処理したpUC18とライゲーションを行ない、大腸菌JM109に形質転換しました。
SmaI/CIP処理したpUC18単独の物ではコロニーが3つ、Alpha Proteobacteriaプラスミド切断物とライゲーションしたものは50個くらいのコロニーが出ました。
参考にした文献では、生えたコロニーを全部液体培養し、インサートの有無やサイズチェックをしてパターン分けし、それらの代表的な物をAlpha Proteobacteriaに入れ直して生えてくる物を探していました。
しかし、50個培養するのも、プラスミド抽出をするのも大変なので横着できないかと考えています。
そこでお聞きしたいのですが、コロニーが生えたプレートにTEを5mlくらい入れてコロニー懸濁液を作り、そこからプラスミド抽出をするのってできるでしょうか？
プラスミドライブラリーを作る時も同様のことをしているようなので、やれそうなんですがシャトルベクター作製でも同じ手法がとれるのか心配です（収量的に）。
プラスミドが採れた場合、それをAlpha Proteobacteriaに入れてアンピシリン耐性コロニーを拾って、シーケンスまでするつもりです。 |
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