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GC richな配列のシーケンス トピック削除
No.790-TOPIC - 2011/08/18 (木) 18:19:11 - ゆずゆ
GC rich(70%)の配列を読んでいますが、途中まで読めていて、途中からピークが極端に下がるので、二次構造やGC richであることが原因ではと思い、こちらにメールしました。

みなさんはGC richな配列を読むときに苦労されましたか？
もしされた方がいらっしゃいましたら解決策などを教えてください。
自分でもサイクル前の熱変性や2ステップサイクルにするなどしてみたのですが、シーケンス自体が上手くいかなくなってしまいました。

また、DMSOやグリセロールの濃度なども教えてください。

自分はDMSO・グリセロール5%でやっています。
熱変性は@98℃ 5minとA96℃ 10minで行い、
step1 98℃ 1min
step2 98℃ 10sec
step3 50℃ 5sec
step4 60℃ 4min
step2〜4を25サイクルで行いました。

2stepも時は
step1 98℃ 10sec
step2 60℃ 4min
step1〜2を25サイクルで行いました。


どうぞアドバイス等よろしくお願い致します。　
　
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GC　rich 削除/引用
No.790-6 - 2011/09/15 (木) 11:12:58 - ema
>GCリッチやヘアピンなどの場合、DMSOよりも1M ベタインの方が効果がありました。
>Applied Biosystemsの3730のシークエンサーを使ってて、

私も１MベタインでOKでした。
ABI3130で試薬ABIのDye3.1(基本試薬1.1ですがこうゆう時は）で読めています。
サイクル、熱処理等はそのままで。

＞途中まで読めていて、途中からピークが極端に下がるので、

すこしテンプレートDNA量を控えても良いかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.790-5 - 2011/09/13 (火) 19:14:17 - seq
GCリッチやヘアピンなどの場合、DMSOよりも1M ベタインの方が効果がありました。

今お願いしている外注先が、Applied Biosystemsの3730のシークエンサーを使ってて、
なんの問題無く、GCリッチだろうがヘアピンだろうが読んでくれているので、
シークエンサー本体の性能も関わってくると思います。
（試薬は、普通のApplied Biosystemsの純正品のみのようです。）

どうやら、Applied Biosystemsの3730はキャピラリーの温度を上げることによって、
高次構造をほどいて泳動しているみたいで、そのお蔭なのでしょうかね。

日本ではどういう状況なのか分かりませんが、
学内か研究所内か、受託解析会社のどこかにあるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.790-4 - 2011/09/13 (火) 18:49:07 - ねこぱんち
通常の方法でシーケンスができない時に、制限酵素でプラスミドのどこか一カ所を切断処理してからシーケンスをかけるとうまくいく場合が在ります。

うちではシーケンスできなくて困った時の手段です。

GCリッチな配列でもこの手法が効果的かはちょっと断言できません。

立体構造が原因であるならば、結構使える手段だと思います。

プラスミド切断
▼
切り出し、精製
▼
通常のシーケンス

ご参考になると幸いです。

(無題) 削除/引用
No.790-3 - 2011/08/22 (月) 11:27:46 - へいばん
もう試されているかもしれませんが、
BetaineやインビトロジェンのシークエンスRxエンハンサーはいかがでしょうか？

あと、
以前、これらの方法を試してもどうしても読めなかったことがあり、
Macrogenという会社のSequencing of difficult DNA templates
というサービスを利用したところ、読めたことがあります。

ご参考までに。

(無題) 削除/引用
No.790-2 - 2011/08/20 (土) 18:10:09 - Harmonia
GCもpoly(A)もだけど、うちはCEQ8000で読んでいて読めなくて、クローンをくれたところに「読めない。コツを教えて」と聞いたら、
「ABIでプロトコールどおりで読めるけど、なにか？」
て、言われて、よその研究室にABIを借りに行って、解決したことがある。
ご参考まで。

GC richな配列のシーケンス 削除/引用
No.790-1 - 2011/08/18 (木) 18:19:11 - ゆずゆ
GC rich(70%)の配列を読んでいますが、途中まで読めていて、途中からピークが極端に下がるので、二次構造やGC richであることが原因ではと思い、こちらにメールしました。

みなさんはGC richな配列を読むときに苦労されましたか？
もしされた方がいらっしゃいましたら解決策などを教えてください。
自分でもサイクル前の熱変性や2ステップサイクルにするなどしてみたのですが、シーケンス自体が上手くいかなくなってしまいました。

また、DMSOやグリセロールの濃度なども教えてください。

自分はDMSO・グリセロール5%でやっています。
熱変性は@98℃ 5minとA96℃ 10minで行い、
step1 98℃ 1min
step2 98℃ 10sec
step3 50℃ 5sec
step4 60℃ 4min
step2〜4を25サイクルで行いました。

2stepも時は
step1 98℃ 10sec
step2 60℃ 4min
step1〜2を25サイクルで行いました。


どうぞアドバイス等よろしくお願い致します。　
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