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(無題) 削除/引用 No.783-5 - 2011/08/21 (日) 00:59:26 - ここですか、ガラッ。 分子量が重なるとか位置的に極めて近接してるとかで、１回目のシグナルがあると2回目のウェスタンに支障があるときはストリップすることもありとおもいますが、そうでないならばなにも無理にする必要はないのでは、と思うのですがどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.783-4 - 2011/08/17 (水) 17:59:26 - モモ ストリッピングに使用するバッファーにもよるでしょうが、 ストリッピングのあとのウォッシュが短すぎる印象が・・・ 恐らくブロッキングに持ち込んでますよね。

(無題) 削除/引用 No.783-3 - 2011/08/17 (水) 13:58:11 - ~ まずは使用しているストリッピング剤とマーカーを明らかにしては。

(無題) 削除/引用 No.783-2 - 2011/08/17 (水) 12:41:24 - 初心者 追加ですが、ストリッピングした後のメンブレンは、のっているタンパクが少ないため、1次抗体の希釈を通常より濃くしなければならない、という可能性はあるでしょうか？

Western blottingのリプロービング 削除/引用 No.783-1 - 2011/08/17 (水) 12:33:00 - 初心者 初歩的な事ですが、教えて下さい。 Westernで、ストリッピングした後のメンブレンで、必ず出るべきバンドが検出できず困っています。ストリッピングする前の、1回目の反応では、目的のバンド(前述のバンドとは別ですが)は検出できています。 実験の流れとしては、1回目のバンド検出の後、TBS-Tで洗浄(10分)→ストリッピング剤でストリッピング(data sheetに従い、室温15分震盪)→TBS-Tで洗浄(10分)→5%ブロッキング剤で室温、1時間震盪→TBS-Tで洗浄(10分×2回)→１次抗体反応(4℃,over night)→TBS-Tで洗浄(10分×2回)→2次抗体反応(室温、1時間)→TBS-Tで洗浄(10分×2回)→検出試薬で検出、です。 実験の過程としては、ストリッピングしていないメンブレンであれば、検出はできます。気になるのは、ストリッピングした後のメンブレンからの検出では、マーカーのバンドすら検出されません。 原因としては、何が考えられるのでしょうか？ ストリッピング剤が強すぎて、タンパクが剥がれたのでしょうか？ それと、マーカー自体がバンドとして検出される原理を分かっていないのですが、マーカーにはHRPが含まれているから、バンドとして検出されるのでしょうか？（1,2次抗体反応なしで、マーカー＋検出試薬だけでも、バンドは出るのでしょうか？）

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