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(無題) 削除/引用 No.768-7 - 2011/08/11 (木) 13:32:16 - hepat アドバイスありがとうございます。 ブロッキングにおいては二次抗体の非特異でないことは確認できました。 希釈倍率に関しては数倍の違いでは変わらないということは勉強になりました。さらに希釈倍率をあげて再検討中です。 確かにきれいな組織染色は一番の目的です。特異性はあるようですので、条件検討やってもダメであれば新しい抗体も検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.768-6 - 2011/08/11 (木) 11:10:52 - るん Ki-67抗原に対する抗体は、マウスモノクローナル抗体MIB-1を用いることが一般的です。 これに抗原賦活を組み合わせきれいに免疫染色することができます。 うちの施設では、pH7のクエン酸bufferマイクロウェーブ10分で行っています。 賦活後、過酸化水素メタノール→PBSwash→ブロッキング→1次抗体の順でよいと思います。 注意点は、Ki67のような核内抗原を染色する時、2次抗体にシンプルステインやEnvisionのような分子量の大きな標識2次抗体を用いると、偽陰性になってしまうことがあるので、ABC法で染色します。 私もマウスを扱いますが、この方法でうまくいっています。

(無題) 削除/引用 No.768-5 - 2011/08/11 (木) 10:33:44 - Jin ・ブロッキングの時間を長くする。 ・一次抗体にTriton-Xを添加する。 ・一次抗体、二次抗体を滴下する前に遠心する。 などの方法は論文でもよく見かける方法ですし、 バックがなんとなく少なくなるような気もします。 ただいずれにせよ、組織さんのおっしゃるように 一次抗体が濃すぎるのではないでしょうか？ どこの抗体を使われているのかわかりませんが、 Ki67は500-1000で十分なものもありますよ。

(無題) 削除/引用 No.768-4 - 2011/08/11 (木) 10:26:48 - ~ 試したブロッキングの条件は何でしょうか？ 二次抗体のホストの正常血清でブロッキングしてみれば、二次抗体の非特異な結合が原因であるかは分かると思います。 抗体を変えてみることができるのであれば、変えてみればいいのではないでしょうか。 目的はその抗体を使いこなすことではなく、いい染色像を得ることのはずです。

(無題) 削除/引用 No.768-3 - 2011/08/11 (木) 08:31:23 - 組織 抗体は信頼できるものでしょうか？ 抗体濃度をふる時は10倍くらいの方がいいと思います（50、500、5000など）。2〜3倍くらいだと染色態度は大きく変わらないです。 一次抗体をもう少し希釈したら、バックが抑えられるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.768-2 - 2011/08/11 (木) 07:47:16 - う ＞いろんな条件でトライしてみましたが、結果が同じでとても悔しいです。 いろんな条件とは？

免疫染色 削除/引用 No.768-1 - 2011/08/10 (水) 21:34:22 - hepat マウス組織の免疫染色をやってます。 目的の蛋白はki67。 臓器は肝臓です。 陽性コントロールとしては同マウスの腸管を用いています。 ホルマリン固定後、パラフィン処理しております。 前処理は、マイクロウェーブ90℃20min→1%過酸化水素水メタノール20min→ブロッキング15min。 抗体はウサギPoly。 希釈倍率は50・100・200倍で検討してみました。 ヒストファインのシンプルステイン(DABも)を利用しています。 結果的には非特異反応が強く出てきます。コントロールをみてみると確かに腸陰窩の部位の細胞の核が特異的に染まっているのですが、他の筋肉なども結構強く非特異が出てきます。見た目としては良くないです。いろんな条件でトライしてみましたが、結果が同じでとても悔しいです。凍結でもやってみましたが、やはり同じ結果でした。 抗体を変えるべきでしょうか？ このような状況で非特異を抑えるにはどうすればいいでしょうか？ いろいろな本を参考にはしておりますが、まだまだ経験が浅く困っております。アドバイスいただけたらと思います。よろしくお願いします。

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