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リフォールディングについて 削除/引用 No.758-10 - 2011/09/20 (火) 16:17:14 - kwai 変性剤で変性させてリフォールディングする方法については、 まだあまり詳しい書き込みがないようですので、そちらについて。 リフォールディングは蛋白質ごとに最適なやり方が違うので、 いきなり上手く行くケースは少なく、細密な条件検討をしなければなりません。 （条件検討だけで半年くらいかかることも多いので、正直あんまり お勧めはできません） 細かいお話の前に、そういうリフォールディングの例を集めた データベース（refold）があるので、そちらをご紹介しておきます。 http://refold.med.monash.edu.au/ さて、リフォールディングについて。 例えば6Mグアニジン塩酸塩で変性させておいて、段階的に 6M→3M→2M→1M→0.5M→0Mというふうに変性剤の濃度を 下げていくのですが、最もメジャーな方法として、 透析によって下げるやり方と、希釈によって下げるやり方があります。 透析の場合、例えば6M Gdn-HClで変性させたサンプルを、 次は3M Gdn-HClの溶液に数時間〜一晩透析し、それを今度は2Mの 溶液で透析し・・・というのを繰り返していきます。 希釈の場合、6M Gdn-HClのサンプルを例えばまず2倍希釈して 数時間〜一晩置き、次にそれを2/3に希釈、それを1/2希釈・・・ というふうに希釈します。最終的に50〜100倍程度まで希釈することが 多いです。こちらは体積が容赦なく増えていくので、最後に 濃縮のステップが必要になります。 また、凝集抑制剤として0.4M アルギニン塩酸塩を加えることが多く、 最近発表されているリフォールディングの例ではほとんど入っています。 またジスルフィド結合をもつ蛋白質の場合は、リフォールディング中に ジスルフィド結合の形成もしなければならないので、酸化剤を加えます （例えば 酸化型グルタチオン）。 近年は、酸化剤：還元剤を10:1程度の比率で加え、リフォールディング中に 誤ったジスルフィド結合が形成されても、ジスルフィド結合の交換を繰り返して 正しい構造に辿り着けるよう、酸化剤：還元剤を１：１０程度の比率で 加えることも多いです（酸化型グルタチオン/還元型グルタチオン、 システイン/シスチン等）。 「どうやったら上手く行くか」というのは相変わらず「やってみないとわからない」 ので、とりあえず何かしら似たようなリフォールディング例を見つけて、 そこからマイナーチェンジで最適化していく、というのが良いかと思います。 似たような例がなければ、メルクからiFoldというリフォールディング条件96通りを 少量でスクリーニングできるキットも市販されていますので、始めるならばこの辺りから 始めてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.758-9 - 2011/08/13 (土) 00:52:37 - おお バッファーにEDTAを使っているとか・・・ Some protease inhibitor cocktails contain EDTA.

(無題) 削除/引用 No.758-8 - 2011/08/12 (金) 15:25:51 - モモ バッファーにTrisを使っているとか・・・

(無題) 削除/引用 No.758-7 - 2011/08/11 (木) 16:21:53 - おお sarkosylでかようかしてGSTにかけるというのをみたことがあります。さるこしる存在化でつくのか薄めたり透析しないといけないのかは思い出せません。興味があれば調べてみればどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.758-6 - 2011/08/11 (木) 15:53:06 - pap 目的のタンパク質が発現していることは確認されましたか？

Competent Cell 削除/引用 No.758-5 - 2011/08/10 (水) 11:39:59 - StReSsReSeArChEr 同じような経験を最近までしておりました。 SoluBL21（Genlantis）という可溶化しないタンパク質を可溶化するというCompetent Cellを購入して試してみたところ、いまのところうまくいっております。 もしラボに金銭的余裕があれば試してみる価値はあると思います。 コスモバイオが現在取り扱いをしているようです。 ご参考までに＊

(無題) 削除/引用 No.758-4 - 2011/08/09 (火) 18:05:30 - M ご回答ありがとうございます。 さまざまな界面活性剤(Triton,NP-40,CHAPSなど）は試してみましたが有効なものはありませんでした。 次回GSTで精製する際には低濃度の変性剤を使用してみたいと思います。 > そもそも、その融合タンパク質がの設計にミスがあるのか、 > 操作が間違っているか、ということのチェックはされましたか？ 変性剤存在下での精製について、操作ミスや設計ミスについては問題ないことは確認しています。 変性剤を用いると可溶化はするのですが、構造的な問題なのかどうしてもNiカラムとの結合が弱いようです。

(無題) 削除/引用 No.758-3 - 2011/08/09 (火) 15:17:53 - う どういう状況か想像はできますが、 正直、文章からは、問題の焦点がぼやけてよくわかりません。 ＞タグはHis,GSTの両方で試みていますが、タンパク質が可溶化せず、 とありますが、 ＞尿素やグアニジンを用いて変性させても ともあります。 つまり、変性剤を加えると可溶化するということですよね？ であるならば、（ご存しだとは思いますが）Hisタグは変性剤の存在下で 精製が可能です。 であるのに、 ＞タグとのアフィにティーが弱いのか全く取れてきません。 これは、よくわかりません。 そもそも、その融合タンパク質がの設計にミスがあるのか、 操作が間違っているか、ということのチェックはされましたか？ 「Hisタグの変税剤存在下で精製ができない」 まず、これが、ひとつの問題点であると思います。 私の経験ですが、不可溶性のタンパク質で変性剤（８Mウレア）の存在下でも 問題なく精製できました。 （その後、変税剤を除いた場合の可溶性については、ここで言ってもしょうがないかと） そして、�@に対する答えですが、 徐々に変製剤を除いていく、ということを行なうとうまくいくことが 「ごく稀」にあります。 透析で少しずつ変性剤の濃度を減らしていくという方法などです。 しかし、あまり期待はできないと思います。 �Aについては先に述べた通りです。

(無題) 削除/引用 No.758-2 - 2011/08/08 (月) 10:55:05 - AP 膜タンパク質を大腸菌で発現させたばあい、二通りのことしか起こらないといっていいでしょう。大腸菌が死んでしまうか、封入体になるかです。なので、死んでしまって何も取れないよりましで、不溶化するのは当たり前と思ってください。 GSTのアフィニティー精製でも、ある程度の変性剤（1 Mだか2 Mだかの尿素、グアニジン）は許容するはずなので、その範囲で試してみる。 アフィニティー精製が唯一の精製法ではないので、変性可溶条件下でゲルろ過しサイズフラクションするなどの方法で精製する（可溶化区分と違って封入体にはそれほど多様、大量のタンパク質は混じってきません）。 あと、その後どういう実験に使うのかわかりませんが、精製したタンパク質は基本的に不溶性でしょう。界面活性剤やリポソームの使用などを検討しなければならないかもしれません。

不溶性タンパク質の精製 削除/引用 No.758-1 - 2011/08/08 (月) 10:25:42 - M 私は現在膜タンパクの精製を行っているのですがどうしてもうまくいきません。 タグはHis,GSTの両方で試みていますが、タンパク質が可溶化せず、尿素やグアニジンを用いて変性させてもタグとのアフィにティーが弱いのか全く取れてきません。そこで質問なのですが、 �@GSTの場合変性剤を抜かないとアフィにティーカラムにかけられないと思いますが、現段階では透析後に沈殿ができてしまっています。変性剤をうまく抜く方法はありませんか？ �A不溶性タンパク質の精製でうまくいった例があればお教えください。

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