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(無題) 削除/引用 No.757-5 - 2011/08/07 (日) 14:26:28 - 心配性 皆さん回答ありがとうございます。 100ng/μlのプラスミドは数回のassay分を調整して使っていこうと思います。 プラスミドのコンタミの件に関しては、 自分の操作を信じてチップを交換していたということで実験を進めたいと思います。 実験でプラスミドを結構用いているので 今のストックがなくなる時に、再度シークエンスをかけてみるというような感じで行きたいと思います。 本当に回答ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.757-4 - 2011/08/06 (土) 16:52:56 - あ こういうちょっとした、実験手引書にもあまり明記されていないようなことを、研究室で身近で聞く人がいないとかわいそうだな、とちょっと思いましたので。。。 私もLuc assayをルーチンにやっています。100ng/μlはうすくないと思いますよ。 うすくすると器壁やチップに吸着した分の誤差が大きくなるから良くないと思ってます。 私はDNAは必ず凍結で保存しています。マキシプレップした純度が高い物でも凍結保存です。分注はしていません。使った後再凍結しています。 私もコンタミを確認する方法はないと思います。ちょっぴり混じっているというのは、混じっていないのと区別がつきません。。。シングルコロニーを拾い直した方が安全ですよ。 ちょっぴり混じっているのが無視できるならいいですが、よほど度胸がないと、あとでかならず心配になる時が来る気がします。（分与を頼まれた、とか、データが再現性しなくなった時とか）

(無題) 削除/引用 No.757-3 - 2011/08/06 (土) 13:34:44 - おお ホントは研究室のうえのひととよく議論するのが筋だと思いますが。研究室のやり方があってそのやり方と違うことを教えた時ややこしくなりますから。 DNAは化学的には安定な物質です。なので酵素てきなコンタミがない限り理想的には室温で放置していても大丈夫です。ただし光にはそんなに強くないかもしれません。 濃度が高い方が安心という気持ちは私もあります(あまり科学的ではないのですが。。なのでその論拠もあえて書きません)。ワーキングソリューションとして100ng/ulの溶液を作っておいて(その一連の実験で使うだろうという量をみつもって)短期なら4度、長期なら分注して凍結し一度凍結したものはサイド凍結しないとしておけばどうでしょうか。 ただ個人的な感想では100ng/ulはそんなにめちゃくちゃ低い濃度でもないとおもってます。物の見方によってかわるでしょうけど。 >作製したプラスミドを無意識で分注をしている時に、チップを交換したか否か不安になってしまいました。 まずこれを防ぐ工夫をまず考えておくべきではなかったでしょうか。コンタミしたならオリジナルのクローンのチューブまで戻るか、トランスフォーメーションしてシングルクローンを拾って配列を確かめるしかないです。 ただし、もしミューてーションで制限酵素認識配列ができたり、潰れたりするならシーケンスの必要はないです。どの程度のコンタミによるかもしれませんが、それをマンマルの細胞とかにとらんジェンとに発現させるかぎりなら(そこから新しくトランスフォーメーションして新たに大腸菌から精製しないのであれば)実験がある程度可能かもしれません(ただし危険性も伴うことはちゃんとはあくしておくべきですが)。

(無題) 削除/引用 No.757-2 - 2011/08/06 (土) 13:25:20 - 774 プラスミドのコンタミを確認する方法はないと思います。 オリジナルストックから増やし直すのがベストかと。 なければ、一度増やし直してシークエンスですかね。 コンタミの可能性がある状態で実験しても、データを信頼できないでしょうし。

プラスミドについて 削除/引用 No.757-1 - 2011/08/06 (土) 12:15:24 - 心配性 いつも拝見させていただいております。 実験2年目の修士1年です。 質問が複数あると共に、各質問に相関がないのですがすみません。 基本的な質問だと思いますが、皆さんの意見を参考にして 今後の実験生活に役立てていきたいと思っていますので、回答のほどをお願いします。 (1)プラスミドの濃度の薄い状態で保存するとよくないというのを 上司やネットで見かけます。 自分は今、Luc assayをやっているのですが、プラスミドを100ng/μlに希釈して使用しています。 100ng/μlのプラスミドはあまり長期保存しない方がいいのでしょうか？ assayをやるごとに希釈して用いた方がいいでしょうか？ また、プラスミドは‐20℃で保存しているのですが、一度ど溶かしたプラスミドは4℃保存にしたほうがいいのでしょうか？ (2)二つ目は、プラスミドのコンタミについてです。 最近、WTのプラスミドから一つの塩基を変えたミュータントを複数種作っています。作製したプラスミドを無意識で分注をしている時に、チップを交換したか否か不安になってしまいました。 違うベクターがコンタミしているか否かを調べるのにいい方法はありますでしょうか？ 本当にくだらない質問なんですが、回答お願いします。

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