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再度御礼 削除/引用 No.752-7 - 2011/08/07 (日) 07:57:52 - 悩める准教授 さらなるコメント皆様有難うございます。 非常に有意義なコメントを頂けてかなり感謝しています。 ＞ABZO様 当方熱のことを気にしていましたが，確かに超音波で水中ではヒドロキシルラジカルが出るので，それにより更に脂質過酸化が進むような気がします（いやたぶん進みます）。そう考えるとキットにマニュアルって疑問が多いですね。 また，TBARS自体の信用度は確かに微妙な所が言われていますが，当方残念ながら研究費が少ないため抗体などを使用せず実験を行っていた（科研費の3割カットが痛い）のですが，ご指摘にように脂質過酸化以外の酸化ストレスマーカーを見たほうが良いかもしれないのでもう一度その辺を検討して見なければさらなる時間とカネの無駄遣いになりそうなのでまずはMDAや4HNEなどの抗体当たりからあったって見たいと思います。ありがとうございました。 ＞VEC様 さすがにそうですよね。 もちろん組織は液体窒素で凍結後に破砕処理し、粉末状の組織をRIPAに溶かしています。 また，ご指摘のように小動物なためかなり低いレンジでの測定になっていますのでサンプル量を増やすなどアイデアは重要だと思います。どうにも，マニュアルに従いすぎたのが悔やまれます。 しかしながら，他の方法も検討する必要が皆様のコメントにより重要であることがよく分かりましたので，ちょっと大学に戻って再検討を行いたいと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.752-6 - 2011/08/07 (日) 06:25:35 - VEC もちろん組織は液体窒素で凍結後に破砕処理し、粉末状の組織をRIPAに溶かしています。 ソニケーションは氷水にチューブを浮かべて処理するタイプのものを使いました。20秒ON-20秒OFFで7-8サイクルくらいだったでしょうか。 小動物の口腔粘膜であればそれほど高い値が出ないと推測しますがいかがでしょうか。低濃度のスタンダードが不安定ということも考えると、サンプル量を増やす（または全体をスケールダウンしてサンプルの相対量を増やす）ことで高濃度域で比較すると信頼性が上がるかもしれません。もちろん、他の手法をご検討されるのも重要かと思います。

(無題) 削除/引用 No.752-5 - 2011/08/07 (日) 01:30:44 - ABZO いや熱とかそういうことじゃなくて、超音波処理って泡とかが出来たり壊れるときとかにフリーラジカル発生させて試料を傷めるから注意しなさいって昔がっこの生化学の実習で先生に習ったので、（キャビテーションとかそういうやつとおもう）それでどんなもんかな？っておもったんです。とくに脂質過酸化って保存中とかいろんなことで進みやすいし。あと脂質過酸化でないといけない特別な理由があるのかな。大昔はTBARSくらいしか方法がなかったからこれが主流だったけど(この方法じしん評価は賛否いろいろだったみたいだけどね)、いまはもう核酸や蛋白質の酸化傷害マーカーもいまはいっぱいあるし、また脂質の酸化傷害をみたいということでも、産物としてのMDAや4HNEやアクロレインとかの修飾蛋白質を抗体つかってウェスタンや評価することもできるし。 選択肢はいろいろあるから、試してみたらどうかな。

御礼 削除/引用 No.752-4 - 2011/08/06 (土) 22:49:35 - 悩める准教授 皆様ご回答ありがとうございます。 caymanのキットは説明書にソニケーションをするように書いてるのでそれに従ってます。 >VEC様 ご回答ありがとうございます。 確かにcaymanのキットのスタンダードはどうにも低濃度の着色幅が小さすぎるので気にはなっていました。スタンダード曲線としては綺麗に書けるのですが低濃度だけで見ると，当方は蛍光ではやっていないので微妙な感じでしたのでインキュベーションの時間を延長してみたいと思います。また，ご回答で気になったのですが，組織を摘出後そのままRIPAにいれて超音波だけでは，見た目に組織はほとんど粉砕できないと思うのですが大動脈は粉砕されるのでしょうか？一度口腔粘膜でRIPAに入れて超音波のみをかけたことがあるのですが，見た目にはほとんど変化がなかった（15sec 40V)のでクライオプレスをかけています。 ＞ABZO様 ご回答有難うございます。 確かにROS系の分析で特に脂質過酸化を見る上で熱のかかる超音波をかけるのはどうかと思うのですが，マニュアルがそうなっているので行ったところであります。ただ，このキットがその辺が考慮されているのかは不明でありますが，マニュアルには on ice と表記がありますので，さすがにそれには従ってます。

(無題) 削除/引用 No.752-3 - 2011/08/06 (土) 21:26:56 - ABZO そんな詳しくわかんないけど脂質過酸化とかみたいく活性酸素の傷害のassayするんならやっぱ超音波はよくないような気がします。もしうちらがやるとしたらとりあえずしないです。もしかしたらそのキットは影響でないような改良がなされているのかもしれないですが。

(無題) 削除/引用 No.752-2 - 2011/08/06 (土) 01:39:12 - VEC 同じCaymanのキットを使い、大動脈のTBARSを測定したことがあります。 スタンダードはきちんと測定できているのでしょうか？ あのキットはスケールダウンして使用できますが、エッペンチューブではなく何らかのスクリューキャップ式チューブの使用をお勧めします。蒸発によるロスを防げます。 あと、スタンダードの低濃度域は変色が弱く、場合によっては1.5-2.0倍のインキュベーションで改善することがあります。 私の場合、大動脈を液体窒素で凍結して組織破砕機で砕き、そのままRIPAに溶かしてソニケーションし、遠心後の上清を使いました。150ug程度のライセートを使いました。砕いた後にホモジェナイズは追加していません。

TBARS測定 削除/引用 No.752-1 - 2011/08/04 (木) 11:32:22 - 悩める准教授 現在、ハムスターの口腔粘膜に炎症を惹起させ、組織を回収しCaymanのTBARS assay kitを使用しTBARSの測定を行っていますが、炎症があるにも関わらずいいデータが得られません。 プロトコルにしたがって測定を行っていますが、組織のホモジナイズの説明のところで組織摘出後RIPA bufferに入れソニケートすることになっています。しかしながら当方はクライオプレスにて組織を粉砕しているのですが、やはりソニケーションはしなければいけないのか、その辺が引っかかっています。 上記以外は、疑問点がないのですが、はたしてソニケーションの問題だけなのかその辺が不明で悩んでいます。 どなたか、測定に関して何か特別な方法やアイデア等お持ちであればご教授いただきたくお願いいたします。

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