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(無題) 削除/引用 No.751-2 - 2011/08/03 (水) 22:20:41 - おお まずは何が原因か追及することが必要です。トランスフォーメーションでコロニーは何個できたのか。いんたくとのプラスミドをトランスフォーメーションした場合どの程度のコロニーがあなたのコンピテントで期待できるか。ライゲーションしないでトランスフォーメーションするとどの程度のコロニーが得られるか。それである程度原因が分かってくると思います。 DNA検出のときのUV照射が悪いと言うこともあります。大部分を銀紙でおおって切り取るということも考えた方がいいかもしれません。

Ligationのトラブル 削除/引用 No.751-1 - 2011/08/03 (水) 19:45:57 - JvN はじめまして、Ligationで少し困っています。 現在ベクターの構築を行っています。 手法としてはTOPOベクターに導入したinsert(1500bp)をまず制限酵素処理（sal1,not1)し、ゲル抽出（takara Reco Chip)を行っています。 ベクター（9900bp)も同様に制限酵素処理後、ゲル抽出を行っています。 その後ゲル抽出した後にエタノール沈殿により精製した後、Ligation反応を行っています。LigationはtakaraのLigation Mixを用いて行っており、insertとvectorのモル比は６：１で行っています。 Ligation後大腸菌にトラフォメした後にplasmidをminiprepで回収し、制限酵素処理にて目的のベクターが得られたか確認しているのですが、どうもうまくいきません。 制限酵素処理し、そのサンプルを電気泳動しバンドでを確認したところ Topoベクターらしきものが確認されます。 いろいろと試してみたのですがどうもうまくいません。 アドバイスいただけると幸いです。

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