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(無題) 削除/引用 No.748-10 - 2011/08/05 (金) 10:47:47 - bird なんと、PromegaのPoly(A) mRNA Detection Systemは生産中止、代替品も無しらしいです。。。なぜ。。。 Poly(A)-FISHにするにしても色々問題がありそうですね。設定の手間も大変そうですし、RIは出来れば面倒だし避けたいです。 kitじゃなくて自前でやるか、、、。うーん困りました。

(無題) 削除/引用 No.748-9 - 2011/08/04 (木) 16:30:26 - ~ FISHは平面培養や浮遊細胞であればやりやすいと思いますが、 100細胞程度ということは、外側と内側の細胞がありますよね。 それらを均一にハイブリダイズさせて、厚みのある細胞塊全体を反映した蛍光量を定量化するのは結構大変だと思いますが… 均一なハイブリダイゼーションをするステップに問題が無く、蛍光の感度だけが問題になるのでしたら、 p32でラベルしたプローブでin situ hybridizationした分を、液体シンチレーションカウンターで測定できるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.748-8 - 2011/08/04 (木) 14:45:10 - おお ルシフェラーゼ自身はRIに近い感度を持っていますから蛍光ではちょっと寂しいですね。APでケミルミのほうがまだ近い感度が出せそうですが。

ありがとうございます 削除/引用 No.748-7 - 2011/08/04 (木) 10:32:26 - bird ~さん、おおさん、emaさん、早速情報を頂きまして、どうもありがとうございます。 PromegaのPoly(A) mRNA Detection Systemは良さそうですね。これを購入してみようと思います。 今回使用するサンプルでは、Total RNA量が1.5ng程度らしいので、mRNAがその1-5%程度だとすると、15-75pg/1sample。上記のキットでは20-40pg/ul、final 10ulくらいなら検出可能なようなので、最終的に1測定あたり200-400pgのmRNAが必要なようです。だとすると、10sampleくらいを混ぜて測定することになりそうです。さすがに1sampleだけで測定は難しいですね。 さらに感度が上がれば良いですが、こういった生化学的な測定手法だとこれくらいが限界なのでしょうか。 個人的には全く別の手法として、poly(A)のprobeでRNA-FISHをして、その蛍光強度を画像で定量的に測定するのもアリかなと思いました。 いずれにせよ、上記のキットを購入して実験してみようと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.748-6 - 2011/08/03 (水) 17:07:07 - ~ おおさんの書かれているのは http://www.promega.co.jp/automation/pdf/PolyATQnt962K.pdf http://www.ebiotrade.com/buyf/productsf/Promega/tb282.pdf のことですね。 20pg/uLでも定量できているようですので、細胞数が少ないこと自体は問題無さそうですね。 胚の中央部分まできちんとlysisしてRNAを回収する部分が次のネックでしょうか。

サンプルに既知のコントロールRNA 削除/引用 No.748-5 - 2011/08/03 (水) 15:46:26 - ema 間違えて本文入れる前に送信してしまいました。 サンプルに既知のコントロールRNA、でそれの増幅率からもとのmRNAの増幅を考えるというのは？

サンプルに既知のコントロールRNA 削除/引用 No.748-4 - 2011/08/03 (水) 15:42:23 - ema

(無題) 削除/引用 No.748-3 - 2011/08/03 (水) 12:04:45 - おお プロメガがキット売ってました。たしかぎゃくてんしゃして、しょうししたdNTPをるしふぇらーぜではかるとか、すでにあるこめんとのようなほうほうろんだったとおもいます(ごめんなさい、かんじへんかんいまできません)

(無題) 削除/引用 No.748-2 - 2011/08/03 (水) 11:17:39 - ~ たんなる思いつきですが。 dTをウェルに固相化しておいて、サンプルをインキュベートして結合させた後に、ラベル化したdAで残ったdTを定量化する。 増幅と、固相化dTへのアニーリングのどちらが偏りが少ないのかは分かりませんが、 少なくとも増幅の場合は、各mRNAの長さの偏りの影響を解決する必要があるでしょうね。

微小サンプルの総mRNA量の定量法 削除/引用 No.748-1 - 2011/08/03 (水) 10:40:08 - bird マウスの微小サンプル（着床前胚1つ：100細胞程度）の総mRNA量を定量する方法を探しています。Total RNA量ではなく、メッセンジャーRNAの総量です。 cDNAをIVTなどで定量性を持たせた状態で増幅して、nano-dropなどで定量するのが良いのかなとも思うのですが、増幅過程を経ることで信頼性を確認するのが難しいのかなと思っています。 何か良い測定法を教えて頂けませんでしょうか？ 皆様宜しくお願いします。

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