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(無題) 削除/引用 No.743-10 - 2011/08/09 (火) 23:44:42 - REP アドバイスありがとうございます。 そうですね。使い慣れている抗体にとどめておこうと思います。その先輩は初回使用の抗体でもブロッキング無しでやっているとのことですが（笑）。

(無題) 削除/引用 No.743-9 - 2011/08/09 (火) 13:53:41 - 効率 急がば回れ 失敗したときに、すぐに原因ってこれじゃないかって思いつくようなステップを作るとめんどうなことになるぞぉ。 頻繁に使っている抗体だったら、このくらいの検出感度やバックだから、ブロッキング時間減らしてもいいんじゃない？ってなるけど、 全く使い慣れていない抗体だったら、そんな数時間、数十分の差で実験がどうこうって言ってる意味あるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.743-8 - 2011/08/09 (火) 10:14:43 - とおりすがり 若干の効率化で実験して、バックが高いとショックです。 再度サンプル調製から始めたら本末転倒かと・・・ 予備実験ならいいと思いますが、皆さんがおっしゃるように問題があるなしは抗体によるでしょうし、論文用のデータ取りの際は慎重に。

(無題) 削除/引用 No.743-7 - 2011/08/07 (日) 07:32:33 - REP 皆様回答ありがとうございます。 総合して、一般的なプロトコールよりはだいぶ短縮しても良さそうな感じですね。若干の効率化になるかもしれません。自分でも試してみます。

(無題) 削除/引用 No.743-6 - 2011/08/06 (土) 16:33:25 - あ ピアスのファーストウエスタンキットだと、転写したメンブレンをwash bufferですすいだだけで、一次抗体液とインキュベートします。使いましたがうまく行きました。

(無題) 削除/引用 No.743-5 - 2011/08/04 (木) 09:38:12 - サボりすぎ わたし、ブロッキング１０分、洗い１０分（２−３回の合計時間）で特に問題ありません。 当たり前ですが、抗体によると思います。（私の場合、５種ほどの抗体で特に問題なし） サボりすぎかもしれませんが、１次、２次抗体洗浄は７分x２回です。オーバーナイトで１次抗体をインキュベートするのでそれで助かっているのかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.743-4 - 2011/08/03 (水) 23:18:28 - REP 皆様ありがとうございます。 実際、ブロッキングはかなり短時間でもよいのかもしれませんね。抗体がよければ結構適当でも大丈夫だし、抗体が悪ければいくら念入りにやっても限界があるようにも思えます。 ミリポアのプロトコールはユニークですね。他社のPVDFでも使える技なんでしょうか。バックがどうしても高いときに試してみます。

(無題) 削除/引用 No.743-3 - 2011/08/03 (水) 23:07:42 - ABZO ミリポアのイモビロンPのrapid immunodetection methodっていうのかな。たしかにバックがきれいだよ。最初に膜を乾かすところが大事と思った。

(無題) 削除/引用 No.743-2 - 2011/08/03 (水) 01:53:06 - カイ 原理的に１次抗体にもブロッキング剤が入っているということを考えると、１次抗体（＋ブロッキング剤）をかけた時点でよーいドンでメンブレンへの吸着が始まるわけですよね。 抗体よりも多量にあるブロッキング剤が先にくっつく確率が高いだろうから、OKということでしょう。 私は完全省略というわけではないですが、時間がないときなど、通常１時間やっているブロッキングを３０分、１５分と縮めても問題なくきれいにウェスタンが出ています。もちろん１次抗体はブロッキング剤に希釈しています。 さすがに完全省略は怖いですけど軽くブロッキング剤でウォッシュ５分くらいでも充分だったりするのかも。ものによると思いますが。

ウエスタンでのブロッキング省略 削除/引用 No.743-1 - 2011/08/03 (水) 01:04:44 - REP よろしくお願いします。 先輩研究者（ポスドク歴7年）と話をしていたところ、その方はウエスタンのブロッキングを省略していると聞きました。その方のブロットはいつも綺麗ですし、ハイインパクトの論文もお持ちです。 具体的には、トランスファーの後にTBSTへメンブレンを落とし、TBST+5%milkで希釈した1次抗体とそのままインキュベーションしてしまうそうです。 1次抗体4Cオーバーナイト→TBSTでの洗浄5分4回→2次抗体(TBST+5%milk)室温1時間→洗浄→現像　という感じみたいです。 せいぜい30-60分の工程短縮ですが、同じように省略してもよい結果を得ている方などいらっしゃいますか？

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