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(無題) 削除/引用 No.741-9 - 2011/08/05 (金) 12:32:03 - HPLC Kanataさま、みなさま 外注先に尋ねたら、流速1.5ml/minのままやってみましょうとのことのなりました。Kanataさまのおっしゃるように、MASSのまえで分岐するのかもしれません。それでだめなら、フラクションを取る方法もあるのですね。 今まで、全く考えなかったやり方を教えてくださり、ありがとうございます。なんとか前に進めそうです。

(無題) 削除/引用 No.741-8 - 2011/08/04 (木) 20:50:00 - Kanata 4.6 mm径カラムの至適流速は1ml/minで、1.5ml/minを使ったというのは理論的というより実践的に”押し出した”可能性があります。 シリカの粒子径が5umサイズから3.5umのサイズになっているので、普通に流速を1.5ml/minから0.5ml/minにスケールを下げるのとはまた違うと思いますが、そのあたりメーカーさんは考慮されていることを期待します。 （3.5um粒子径だと保持時間（溶出時間）は早くなります） > ＞・インジェクションが正しく行われていない（オートサンプラーですか？） > > オートサンプラ-ですが。 他の測定で（化合物）で標準化合物の検出ができているならOKですが、インジェクターシールの破損なので注入に問題発生の場合もあります。そのあたりは大丈夫、ですよね。（ここが問題とはあまり思ってませんが） 別の方がおっしゃっていたフラクションを集めることですが、すでにRtがわかっているので、マニュアルで回収してしまえばいいと思います。UV からカラムにつなげるラインをはずし、そこの配管からクロマトグラムを見ながら（ピークに合わせて）溶出液を回収すればできます。 またHPLC流速1.5ml/minのままで質量分析することはできませんが、質量分析計に導入する前にスプリット（分岐）して、MSに0.5ml/min、廃液系に1ml/minとわけてしまえば測定可能です。そこは受託されるところのセッティングによるので相談なさってみてください。 定量ではなく、求める化合物かどうかを知るのが目的であれば、別の方がおっしゃったようにフラクションを回収してMSに導入する方法を私はお奨めします。

(無題) 削除/引用 No.741-7 - 2011/08/04 (木) 17:54:03 - HPLC みなさま ご提案ありがとうございます。 今までの分析をよく見たところ、ピークと思っていたものは、ベースラインのドリフトにすぎないことがわかりました。つまり、分析物はカラムに保持されたまま溶出されてこないようです。 ＞フラクションを取って、自分のラボの検出器でピークを確認して、そのチューブを直打ちでMSに打ってもらえば、別にMSの前にカラムを通す必要がないのでは。 すみません。いままでフラクションを取ったことがありません。使用機器は○aters アライアンス2695です。これってフラクションが取れるのでしょうか？フラクションを取るには何か特別な装置が必要ですか？ ~さま ＞具体的には何がしたいのでしょうか？ それによっては、移動相やカラムの条件ではない部分で解決した方が早いかもしれません。 生体成分を蛍光物質で標識後、HPLCにかけますが、ピークは複数出現します。そのうち2本について、標準物質との保持時間の比較から、この物質ではないかと予想がつきました。この予想が正しいかをMSで確かめるのが目的です。 Kanataさま ＞【測定対象物】低分子、蛍光を有する化合物2つ（もしくは異性体？） 【変更点】C18 5um　4.6*250mmからC18 3.5um 2.1*150mm カラムに 【検出器】どちらのカラムも蛍光検出器使用（で、よいですか？） 測定対象物はチオール基を蛍光標識しています。化合物は1つなのですが、ピークが複数出現し、その内大きい2本をピークについてMSで確認しようと思っています。 ＞・メーカーがプログラムを組み替えたときには、メーカー側でピークは検出できたのでしょうか。 メーカーは計算からプログラムを組換え、ピークを検出は行っていません。 ＞・グラジエントの設定自体の前に、カラムの接続に不具合がある、またはHPLCに何か問題があって、グラジエントがかかっていない カラムの圧力をモニターしています。また移動相の％の経時的変化はモニターに表示されますので、グラジエントはかかっていると思います。 ＞・インジェクションが正しく行われていない（オートサンプラーですか？） オートサンプラ-ですが。 ＞流速が設定した値とは違う可能性もありそうです。（4.6 mm径で1.5ml/minという当初の設定も、有機溶媒リッチなRtで山のようなピークというのも） 4.6 mm径で1.5ml/minという条件は、論文からそのままとってきています。 ＞有機溶媒リッチなRtで山のようなピークというのも） これは私の間違いでした。ベースラインのドリフトで、ピークではなかったです。すみません 移動相をアセトニトリルに変えたり、グラジエントを変えたりと、いろいろ試したのですがうまく溶出できません。 そこで別のアプローチとして、当初の設定、HPLCで流速1.5ｍL/minの分析をそのまま分析できるようなMSシステムがあればいいのですが。ご存知でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.741-6 - 2011/08/03 (水) 16:32:44 - Kanata 【測定対象物】低分子、蛍光を有する化合物2つ（もしくは異性体？） 【変更点】C18 5um　4.6*250mmからC18 3.5um 2.1*150mm カラムに 【検出器】どちらのカラムも蛍光検出器使用（で、よいですか？） 標準物質がMSで測定できるかどうかはカラムを通さずループインジェクションで確認できるのですが（イオン化しずらい構造の場合もあるけれど）、生体試料中の成分ということでMatrix effectを防ぐためにもカラムでの分離はやはり必要だと思います。定量を目的とされている印象がありますが、そうでしょうか。 ・メーカーがプログラムを組み替えたときには、メーカー側でピークは検出できたのでしょうか。 ・グラジエントの設定自体の前に、カラムの接続に不具合がある、またはHPLCに何か問題があって、グラジエントがかかっていない・インジェクションが正しく行われていない（オートサンプラーですか？）流速が設定した値とは違う可能性もありそうです。（4.6 mm径で1.5ml/minという当初の設定も、有機溶媒リッチなRtで山のようなピークというのも） ・どれぐらいの量の標準物質をカラムに注入したのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.741-5 - 2011/08/03 (水) 13:37:21 - ~ 具体的には何がしたいのでしょうか？ それによっては、移動相やカラムの条件ではない部分で解決した方が早いかもしれません。 目的のピークは２本で、今のプロトコルではRTが2分分かれていて、その2本についてMSで定性分析を行ないたいということでいいのでしょうか。 それとも、ピークは多数あり、挙げた2本のピークは標準物質なのでしょうか？ 前者であれば、1.5 mL/minで2分離れていますので、0.5mLずつでもフラクションをとれば、ピークは分離できますよね。 フラクションを取って、自分のラボの検出器でピークを確認して、そのチューブを直打ちでMSに打ってもらえば、別にMSの前にカラムを通す必要がないのでは。

(無題) 削除/引用 No.741-4 - 2011/08/03 (水) 12:19:21 - おお 分解能が落ちてしまってるような感じにおもえました。乗せる量を減らしてもだめでしょうか? もしそういう問題ならその系で長いカラムを使うとか。 もともとのカラムで溶出したものの1ピークを回収してその小さいカラムにのすとどうでしょうか、 標準物質とありますが、何種類か混ぜで分離を見てるんでしょうか? 一つづつのせるとどうなりますか?

(無題) 削除/引用 No.741-3 - 2011/08/03 (水) 10:57:25 - HPLC Kanataさま メールありがとうございます。 詳しい測定条件ですが、 ＞カラムは、○atersのsymmetryC18です。 移動相は酢酸とメタノールで、グラジエント分析を行っています。メタノール濃度を10.5％、24％、30％、50％と増やしていきまた10.5％に戻るというプログラムです。メタノール濃度50%部分ではカラム内圧が高くなりすぎるので（4800psi)、流速1.0ml/minに落としています。 ＞4.6mm径を用いた測定法の時、測定したいものの溶出時間はどれぐらいでしたか。 保持時間11分、13分に出てくる2本のピークです。メタノール濃度では24→30％のグラジエント部分となります。 ＞2.1 mm径を用いて分離ができないとおっしゃっていますが、それはUVで測定してのことなのか、MSにつないでのことなのですか？ 2.1 mm径カラムの分析は、蛍光検出器で行っています。私のいるラボにはMSがないので外注することにしましたが、流速0.5ml/分に落とさなければなりません。そこで、HPLCで流速0.5ml/分で可能な分析条件を探しています。 ＞測定対象物をポジティブモード、ネガティブモードのどちらで測定するかによって移動相も変わるのですが、もう少し詳しい情報はないものでしょうか。 ポジティブモード、ネガティブモードのどちらで測定するかも決まっていません。目的は生体試料中のピークの測定ですが、まず標準物質がMSで測れるかを検討するため、HPLCのプログラムの変更を行っています。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.741-2 - 2011/08/03 (水) 06:45:22 - Kanata シリカカラムとおっしゃってますがC18の意味で使ってますか？ 元々のメソッド、4.6 mm径のカラムで流速1.5ml/minというのもこの径のカラムにしてはふさわしくない流速です。 4.6mm径を用いた測定法の時、測定したいものの溶出時間はどれぐらいでしたか。2.1 mm径を用いて分離ができないとおっしゃっていますが、それはUVで測定してのことなのか、MSにつないでのことなのですか？ 測定対象物をポジティブモード、ネガティブモードのどちらで測定するかによって移動相も変わるのですが、もう少し詳しい情報はないものでしょうか。

HPLCのカラム変更によるメソッドの組換え 削除/引用 No.741-1 - 2011/08/02 (火) 18:29:32 - HPLC HPLCで得られたピークをmassで分析しようとしてメソッドの組換えをおこなっていますが、うまくいきません。メソッド構築に詳しいかた教えてください。 元々は、シリカカラム５ミクロン、4.6X250mmで、流速1.5ml/分、移動相0.025％酢酸ｐH3.9とメタノールでグラジエント分析をしていました。 massで分析するには、流速を0.5ml/分以下にする必要があるので、シリカカラム3.5ミクロン、2.1X150mmを購入し、○atersで新しいカラムに合うようメッソドを組み替えてもらいましたが、標準物質でも分離ができなくなってしまいました。個々のピークがでず、メタノールが多い時間に、すそ野が広くぎざきざした山のようなピークが1本出るだけです。 流速を変えてみたり、メソッドをいじってみたりしたのですが、状況は変わりません。元々もメソッドも論文から取ってきたもので自分で組んだものではありません。 分析に詳しい方、アドバイスをお願いします。役に立つ書籍などありましたら合わせてお知らせください。 よろしくお願いします

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