全部でこちらから10種類くらいの遺伝子、各遺伝子につき4-5のshRNAを購入して使用しました。少ない時でも2つのshRNAはノックダウンを満足できるレベルでしてくれました（mRNAの発現量をqPCRで、蛋白の発現をウェスタンで確認しました。あとは表現型の確認を私の実験内容に応じて行いました）。
当時はvalidationがあまり進んでいなかったので、片っ端から確認していましたが、今は結構validatedなものがありますね。ただ、これがほんとうに大丈夫なのかは実際に自分の実験系に組み込んでみないとわからないとは思います。
私はshRNA組み込み済みのプラスミドを購入していましたが、配列が公開されているので自分で作製するのもアリだと思います(ただ、ちょっとライセンス周りは調べていないのでわからないです)。その際には必要なプラスミドがAddgeneというところから入手できます。こちらです。
http://www.addgene.org/
ここからはパッケージングに必要なプラスミドも全て安く購入できるのでお勧めです。レンチベクターを使用するにあたってのプロトコルも充実しています。
蛇足ですが、ご自身でshRNA発現プラスミドを構築する場合、最後にシークエンスをチェックされると思います。その際にはサイクルシークエンス時にDMSOなどを添加されることをお勧めいたします。入れないとおそらくshRNAの特徴であるヘアピン構造をサイクルシークエンス時にも構成するため（この時はヘアピンDNAですね）、読みにくいことがありました。 |
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