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(無題) 削除/引用 No.723-4 - 2011/07/28 (木) 18:24:18 - QW 効率が悪いので、siRNAを発現しているクローンを単離しました。 クローンの中では、うまくノックダウンされているのがタンパクレベルで確認できたことはあります。

(無題) 削除/引用 No.723-3 - 2011/07/28 (木) 17:45:04 - 51 >> in situ 様 　お返事ありがとうございました。 　 　私はknock downを行うのが初めてで、半分くらいはknock downできないということは知りませんでした。 　ちなみに講習したsiRNAはAmbionのSilencer® Select Validated siRNAを購入して実験をしております。 　蛍光標識をして導入してみたのですが、導入効率は悪いですね・・・。（試薬の問題かと思っておりました） 　ポジコンになりそうな他の細胞が手に入るかわかりませんが、検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.723-2 - 2011/07/28 (木) 14:33:10 - in situ 直接の回答でなくて恐縮ですが… まず、そのsiRNAのknock down効果は確かなのでしょうか？ というのは、siRNAは市販のものでも（validatedと書かれたものでさえも）、導入はできていてもknock down効果を示さないものが結構あります。 今まで50以上のsiRNAを使ってきていますが、下手すると半分くらいはknock downできないです。 ですから、導入効率だけを見たいのであれば、蛍光標識されたsiRNAを用いるとか、既にその細胞でknock downの報告があるものをポジコンとして使った方がいいと思います。

U937へのsiRNA導入エレクトロポレーション法 削除/引用 No.723-1 - 2011/07/28 (木) 13:04:41 - 51 毎回、参考にさせていただいております U937へのsiRNA導入エレクトロポレーション法についてお尋ねいたします。 以前のトピでもありましたが、U937は浮遊細胞でsiRNAをエレクトロポレーション法にてトランスフェクションしておりますが、いっこうに導入できません。 論文では、Nucleofector Kit Vを使用して導入しているようですが、当ラボは資金が乏しく、Nucleofector Kit Tがあり、この試薬で行うように言われているせいかもしれませんが、全く導入できないでいます。 もし、U937にsiRNA導入をエレクトロポレーション法で行なってノックダウンがうまくいったという方がいらっしゃいましたら、プロトコールを教えていただけないでしょうか？ 当ラボでは 細胞数3×10＾6　 siRNA　最終濃度50nM Nucleofector Kit Tsolution でNucleofector（amaxa）のプログラムV-01を用いております。 導入１日後にRT-PCRにて評価を行なっております。

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