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(無題) 削除/引用 No.716-9 - 2011/07/27 (水) 23:36:24 - XAB ・・・あー間違えました。そうですsalineが5mLです。 単に記入の間違えです。実際はsaline5mlで使ってました。失礼しました。 確かに過去のトピックにもありましたが、溶血でよしとしている方もいらっしゃるようですね。培養する場合は遠心して落としたものをまいてしまえばいいんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.716-8 - 2011/07/27 (水) 22:25:45 - ＤＱＮ 私は重層とかは実施せずに、ヘパリン又はEDTA採血した全血に 0.9%塩化アンモニウムを入れて少しインニュベートし、赤血球を 溶血して白血球を取ってます。 末梢血ですと顆粒球リッチですが、あまり気にせずやってます。

(無題) 削除/引用 No.716-7 - 2011/07/27 (水) 13:37:10 - optiprep OptiPrepは1.5mLじゃないんですか？？

(無題) 削除/引用 No.716-6 - 2011/07/27 (水) 11:27:31 - XAB optiprepさま 　ご指摘ありがとうございます。その通り、optiprep 5mL + buffered saline 1.5mLのmixtureのうち5mLを血液と混ぜております。不備失礼しました。 　重層を増やしたのは、0.5mLでは最上層が薄く、表面張力で水面が下に凸のカーブを描いた時にinterfaceがはっきりしなかったためです（15mLのブルートップを使っています）。 　また、当初は0.25-0.5mLの血液量（マニュアルどおり）でやっていましたが同様にうまくいかず、次第に血液量を増やして今に至りました。 　ローターはスイングローターで、rcfと温度はプロトコールどおり、ブレーキをオフにしています。

(無題) 削除/引用 No.716-5 - 2011/07/27 (水) 11:05:20 - optiprep やったことがないのに、お邪魔しますが 質問中のOptiPrep5mLと言うのはSalineで希釈したものなんですよね？ 溶液の分量がご自身で提示されたマウス用のプロトコールとは合わないように思われますが、どうでしょうか？また、TopへのTricine-buffered salineの重層は無くてもよいと書かれておりますが、なぜ0.5mLから1mLへボリュームを増やしたのですか？ 0.25-0.5 ml of blood: 5.0 ml of Solution B, 1.5 ml of OptiPrepの混ぜ物から5mlを加える 5 ml of blood: 2.5 ml of Solution B, 1.25 ml of OptiPrepを加える 以上特に問題が無い場合ですが 他の実験で遠心機のローター（角度）の違ったために計算上は同じ遠心力なのに細胞の層が出来たり出来なかったりで苦労していた方を見たことがあります。アングルローターを使っているのであれば、違うローターを使ってみるというのも、もしかしたら有効かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.716-4 - 2011/07/27 (水) 07:58:30 - axis あ、本当だ。 ヒト用とマウス用ではプロトコールが違いますね。 失礼しました…

(無題) 削除/引用 No.716-3 - 2011/07/27 (水) 07:11:20 - XAB axisさま 早速のコメントありがとうございます。 添付いただいたプロトコール（ヒト用）は承知しておりましたが、ヒトとマウスではdensity mediumの濃度が異なると言うことも聞いておりましたので、マウス用のプロトコール(http://www.axis-shield-density-gradient-media.com/cd2009/cells/C07.pdf)を試してみた次第です。マウス用のほうが少ない血液でも可能のようです。 どうしてもうまくいかなければ力技でスケールアップしてやってしまおうかとも思っているのですが・・・。

(無題) 削除/引用 No.716-2 - 2011/07/27 (水) 07:02:29 - axis 製品が違うかもしれませんが、溶液の密度が違うことが原因な気がします。 ざっと探したみたら下記のプロトコールがありました。 Optiprep 4 mlにTricine buffer 2 ml (WS)、血液サンプル10 mlにWS 2.7 mlなので、だいぶ違うようですが、どうなのでしょう？ http://www.axis-shield-density-gradient-media.com/cd2009/cells/C05.pdf

マウスPBMCの単離がうまくいかない 削除/引用 No.716-1 - 2011/07/27 (水) 06:06:03 - XAB Optiprepを用いてマウスPBMCの単離培養を試みております。 基本的にメーカー提供のプロトコールに沿っておりますが、収量がほぼゼロで困っています。 1. Optiprep 5mL + Tricine-buffered saline 1.5mLを混ぜる。 2. citrateを抗凝固剤としてマウス2匹より採血（total2mL前後）。 3. 血液を1に加え穏やかに混ぜる。 4. Tricine-buffered saline 1mLを重層。 5. 1000rcfで30分遠心。 ここで最上層と中間層のinterfaceにPBMCの層ができるようですが、まずこれがはっきりしません。 めげずにinterfaceを吸引して遠心すると赤いペレットが確認されます。ただこれを溶血処理して遠心するともはや何も残りません。多分赤いペレットはただのRBCだと思います。 メーカーの文書では0.5mLの血液から10x10^5程度のPBMCが取れるということなのですが・・・。単なる効率の問題なのでしょうか？ ご経験のある方、アドバイスを頂ければ幸いです。 よろしくお願いいたします。

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