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(無題) 削除/引用 No.71-7 - 2011/02/26 (土) 13:37:15 - Boston-Pullman Supplemental dataであれば、RT-PCRにこだわらなくとも、免疫染色ではだめでしょうか？ Oct-3/4, SSEA-1 あたりで。個人的にはmRNAの発現よりも機能を持ったタンパク質として存在するのかが重要だと思っています。分化マーカーも。

(無題) 削除/引用 No.71-6 - 2011/02/26 (土) 12:03:57 - Actias Nanog は、細胞をはがしてPBSで洗ってLIFマイナスの培地に入れた時点を0として、1から1.5日でほとんど検出できなくなっていました。 いま、配列がでてこないのでゴメンナサイ。

(無題) 削除/引用 No.71-5 - 2011/02/26 (土) 10:50:19 - Boston-Pullman 所属していたラボでOct-3/4 promoter-EGFPマウス(B6 background、XX)からESを樹立しました。 分化誘導８−９日後には、EGFP陽性細胞はほどんと消えていました。

(無題) 削除/引用 No.71-4 - 2011/02/26 (土) 09:47:54 - kt Actias様、Boston-Pullman様、ご返信ありがとうございます。 E14TG2aでも同様のことが起きる場合もあるのですね。 私は理研から購入しましたB6由来のES細胞を使用していまして、一般的に使用されているE14TG2aやD3等と異なるのは、バックグラウンドの違いか、とも思っていましたが、そうでもないということですね。 なお、使用したプライマーはイントロンを挟んでいますのでゲノムのコンタミはないと考えていましたが、Pseudogeneについては知りませんでした。確認してみます。 ただ、最初に質問させていただいた際には記載し忘れましたが、Oct-3/4だけでなく、NanogもEB形成後において発現に変動はありませんでした。ですので、プライマーの問題ではなく、未分化な細胞が残っているのだろうと考えています。 現在論文投稿に向け補助的なデータを集めているのですが、「EB形成させて未分化マーカーの発現が減少しない」というデータを載せてしまったら、その他のデータを全て信用してもらえないのではないか、と考えてしまいます。。。

(無題) 削除/引用 No.71-3 - 2011/02/26 (土) 01:46:13 - Boston-Pullman ８つくらいはPseudogeneがあります。PCRのサイクル数で判断できるかと思いますが、ゲノムのコンタミの可能性はないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.71-2 - 2011/02/25 (金) 23:06:40 - Actias 僕もE14TG2a で経験しました。 8日目くらいまでは下がりませんでした。 分化マーカーは出てるし、何で？と思いましたが、その後にテーマが変わりましたので突っ込んでません。 RT-PCRのときは、細胞一個一個を見ているわけではないので、細胞の塊の中で場所によって違うのか。だとすると、in situ hybeでみえないかなど思いましたが、実験系を立ち上げようとして、終わりました。 一方、EC細胞ライセートがOct3/4抗体のポジコンとして付いているので、共通点は無いかとか、考えましたが、解決していません。

胚様体形成後にOct-3/4の発現がさがらない 削除/引用 No.71-1 - 2011/02/25 (金) 19:52:04 - kt お世話になっております。 現在、マウスES細胞を用いた実験を行っています。 ES細胞から胚様体（EB）を作製して目的の細胞への分化誘導を行っているのですが、 ５日、７日または９日培養したEBにおいて、未分化ES細胞と同程度のOct-3/4の発現が検出されてしまいます（RT-PCR）。 内胚葉、中胚葉、外胚葉マーカーの発現はEB形成により上昇することは確認できているので、分化が進行していると考えてはいるのですが、、、 どのように考えればよろしいのでしょうか。 なお、EB形成法は96穴の低接着プレートを使用していますし、培地はLIFを除去しています。 ご助言いただけると幸いです。

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