Bio Technical フォーラム

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クロ−ニングの際の制限酵素サイトの付け方 トピック削除
No.708-TOPIC - 2011/07/23 (土) 17:17:28 - Luc
いつも参考にさせていただいております。
DNAワーク初心者で、初歩的な質問で恐縮ですがよろしくお願いします。

cDNAのクローニングの際に制限酵素サイトを導入したいのですが、
プライマーの設計の仕方で戸惑ってしまい投稿させていただきました。
Fwのプライマーはそのまま制限酵素の配列を加えれば良いのは分かるのですが、Rvのプライマーは制限酵素の配列も相補鎖にするべきでしょうか。また、向きもプライマー部分と同様に3'-5'にするべきでしょうか。

EcoRI(GAATTC)とSalI(GTCGAC)で切る場合、下記の設計で良いか教えていただければ幸いです。

(5'-3') Fw; tttt <GAATTC> cDNAの塩基配列
(5'-3') Rv; tttt <GTCGAC> cDNAの相補鎖の配列
　
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お礼 削除/引用
No.708-3 - 2011/07/25 (月) 22:06:43 - Luc
ご回答ありがとうございました。
SalIは末端につけると切れにくいのですね。
勉強になりました。

いろいろ検討してみます。

(無題) 削除/引用
No.708-2 - 2011/07/24 (日) 05:08:41 - おお
リバースでも同じ配列になるのでパリンドロームとよばれています。
Sal Iは末端につけると切れにくくないかなぁ。

あとtをくわえるよりGかCまたはGCだけで構成される配列を末端に置いた方がいいといいますが、、、そうでなくてもワークはするとおもいます。

クロ−ニングの際の制限酵素サイトの付け方 削除/引用
No.708-1 - 2011/07/23 (土) 17:17:28 - Luc
いつも参考にさせていただいております。
DNAワーク初心者で、初歩的な質問で恐縮ですがよろしくお願いします。

cDNAのクローニングの際に制限酵素サイトを導入したいのですが、
プライマーの設計の仕方で戸惑ってしまい投稿させていただきました。
Fwのプライマーはそのまま制限酵素の配列を加えれば良いのは分かるのですが、Rvのプライマーは制限酵素の配列も相補鎖にするべきでしょうか。また、向きもプライマー部分と同様に3'-5'にするべきでしょうか。

EcoRI(GAATTC)とSalI(GTCGAC)で切る場合、下記の設計で良いか教えていただければ幸いです。

(5'-3') Fw; tttt <GAATTC> cDNAの塩基配列
(5'-3') Rv; tttt <GTCGAC> cDNAの相補鎖の配列
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