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(無題) 削除/引用 No.697-5 - 2011/07/23 (土) 00:37:00 - み PBS中で処理してもそれほど短時間では死なないでしょう。 HBSSはカルシウムイオンの有無でプライマリーカルチャーの生死は大きく変わりそうな気がしますがいかがでしょうか？ 昔、カルシウム不含でやるべきところを含でやってDRG neuronが全滅したという話を聞いたことあります。

(無題) 削除/引用 No.697-4 - 2011/07/23 (土) 00:16:49 - 月詠 お書きになっている方法は主に脾臓中のリンパ系細胞の分離を目的とされていると思うのですけど、溶血処理のステップがありませんので、調整した細胞の中にはかなりの数の赤血球が残存すると思います。赤血球はトリパンブルー染色で陽性（青）に染まりますので、それで死細胞率が見かけ上高くなってしまっているのではないでしょうか？ それとも洗浄のステップで用いている洗浄液はlysis bufferなのでしょうか？　その場合は、lysis bufferの組成に問題があるかもしくは処理条件が強すぎて、赤血球だけでなくリンパ球にも作用してしまって死細胞率が増加してしまっているのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.697-3 - 2011/07/22 (金) 16:29:48 - HIH 試薬に問題がある。 HBSSか洗浄液を確認するべき。

(無題) 削除/引用 No.697-2 - 2011/07/22 (金) 13:14:56 - ~ 何が前と同じで、何が違うのですか？ 細胞の温度管理 水のグレード サンプルの調整場所とFACSまでの距離（測定までの時間） 遠心機のでかかっているG はさみ等の器具の洗浄管理（固定液とのクロス、洗剤、リンス、保管等） などは、変わっている場合もあるのではないでしょうか。 また、脾細胞であればトリパンブルー染色でも生存率が見れますよね。 洗浄やストレイナーを通す前にも測ってみてはいかがでしょうか。 はさみで刻んだ時点から生存率が低いのか、洗浄を経てから生存率が下がるのかなど、どのステップが怪しいのかが切り分けられるかもしれません。 ところで、脾細胞を取り出す際にはFBSを入れたバッファーや培地でけん濁するプロトコルをよく見かけるのですが、無血清のバッファーでも問題ないのでしょうか？ 血清を入れることで、死ぬまでの時間が長くなったり、問題のある条件を緩和してくれるかもしれません。

マウス脾臓細胞の生存率について 削除/引用 No.697-1 - 2011/07/22 (金) 11:30:09 - yuｎ 現在、マウス脾臓細胞を用いたFACS解析を行うことを検討しています。 しかし、まず最初の段階である脾臓細胞の生存率が芳しくないためご相談させていただきます。 方法は、マウスから脾臓細胞を摘出後、冷HBSSに取り、ハサミで切り込みを入れた後スライドグラスのすり部分ですりつぶします。 その後、細胞浮遊液を二回洗浄し、セルストレイナーに通した後、細胞数のカウントを行っています。 この時点ですでに生存率が20%前後になってしまいます。 なお、私自身は以前別施設にてこの方法で脾臓細胞を回収しており、その時の平均生存率は90％程度でした。 なお、私以外のものが調製しても同様の状態です。 以前出来ていたことができないという状態なので、解決策がなかなか浮かびません。 どういったことが原因と考えられるのでしょうか？

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