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(無題) 削除/引用 No.695-3 - 2011/08/07 (日) 12:49:28 - ABZO 方法は695-1の人の実験の目的と対象とする蛋白質に大きく依存する（他の実験でも基本的にはそうだけどね）からね。細胞溶かすときまずうちらが考えるのは、この方法で自分のみたいものがちゃんと可溶化されてくるかどうかということだな。低張ショックは数ある可溶化方法のなかではかなりマイルドな方法だよね。活性を維持して抽出したいあるいは、よけいな蛋白質を減らしたいときはメリット大きいけど、得られてくるのは細胞質の可溶性蛋白質が主で、膜蛋白質や多くの核タンパク質、細胞骨格やそれとアソシエートしてるのとかはちょっとむずかしいね。まずこの方法で自分のみたいやつが上手い事回収できてるか、ウェスタンとかで（必ず沈殿と上清の両方ね）確認するのは大事だね。論文になってるやつでもそういうところまでちゃんと確認してやってるのかな？というのもあるよ。（言い換えると、ちゃんと条件検討して至適化すると先行研究が見落としていた大事な事が見えてくることもある。）低張ショックが今一のとき、適切な抽出条件を探るということでマイルドからハードな方法へと段階的な抽出もいいよ。 DTTは使用濃度によるけど10mMこえるとやっぱ分子間／分子内S-Sに影響でるかな。複合体形成にそういう結合が関与していないものなら別にいいかもしれないけど。 また細胞質ならばもともと還元的環境だからできるだけ生理的状態を維持したいなら酸化防止の意味であるていど還元剤あったほうがいいとおもう。だとすると、うちら的にはDTTなら1mMくらいかな。複合体の維持という事では金属イオンや塩、補因子が関与するものもあるから、自分のみたいやつでそういうのがあるかどうか調べてみて必要に応じてそういうのもいれた方がいいかもね。 プロテアーゼ阻害剤を入れるのはOKとおもうけど、まれかもしれないけど酵素活性とか見るとき影響でる場合もあるかもしれない気がするから、もしなんか結果がおかしいなと思ったら一応考慮した方がいいかもね。

(無題) 削除/引用 No.695-2 - 2011/07/28 (木) 06:19:18 - at お好みの緩衝液じゃだめでしょうかねぇ。 言い訳をしやすいように、自分の実験と最も近いと思われる文献と同じ組成を使うことが多いんじゃないでしょうか。

細胞の低張溶解バッファー 削除/引用 No.695-1 - 2011/07/21 (木) 17:25:11 - atgc 培養細胞のホモジネートを調製し、古典的な遠心分離法で分画しようと考えています。 そこで、低張溶液バッファー（hypotonic lysis buffer）の組成について教えて下さい。 ざっと文献を見たところ、HEPESもしくはTris, MgCl2, KCl, DTT, PMSFを含む 組成が多いようです。ですが、各試薬の濃度は文献により微妙に異なります。 細胞種によって、適するバッファーは異なると思いますが、 接着細胞に使用するのに適した一般的なhypo bufferの組成 （またはそれが記載された文献）を教えて下さい。 よろしくお願い致します。 ちなみに、DTTを加えるとその還元作用により複合体形成タンパクはバラけると聞き、 DTTは加えないで調製することも考えています。

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