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(無題) 削除/引用 No.692-7 - 2011/07/21 (木) 14:31:23 - おお >[Re:6] THさんは書きました : > おお様 > チェックしなければならないポイントが多すぎて、どつぼにはまるところでした。丁寧なご指導ありがとうございました。 お気付きと思いますが、一度かかったサンプルは保存しておくと何かの時に役に立つかもしれませんよ。

ありがとうございました。 削除/引用 No.692-6 - 2011/07/21 (木) 13:45:04 - TH 最後の手段でキャピラリーを新しいものに変えたところ、無事きれいに読めました。結局のところ、なぜキャピラリーを変えてうまくいったのかは不明ですが。。お騒がせして申し訳ございませんでした。 一応返信させていただきます。 そりゃ様 本体のほうに問題がありました。実は1か月前にABの人にきてもらって、レーザーを交換したばかりでした。その際、クリーニングもしてもらい、シークエンシングも問題なかったので大丈夫と信じきっていました。 310様 機種名はABI310 genetic analyzerで、ポリマーはPOP-6、キャピラリーは61cmのlongを使用しております。キャリブレーションはしっかり行っていましたし、ゲルのリークもございませんでした。シーケンス産物は、エタ沈後(80%エタ後、70%エタで洗い)にhidiで変性です。 おお様 チェックしなければならないポイントが多すぎて、どつぼにはまるところでした。丁寧なご指導ありがとうございました。 ts様 このようなサイトがあったのですね、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.692-5 - 2011/07/21 (木) 12:46:59 - ts http://www.etonbio.com/troubleshooting.php

(無題) 削除/引用 No.692-4 - 2011/07/21 (木) 04:37:12 - おお もう少し考えて、可能せいをつぶして行くといいかもしれません。反応が大丈夫で(ほんとに大丈夫かは確定しているかわかりませんが)あプライしてシグナルが低いのであればどこに行ってしまったのでしょうか。ゲルその他のレゾリューションが悪くてもどこかにシグナルが来てないかどうか。シグナルがすべてに渡って低いならサンプルが悪いかロスしたというシナリオも考えて良いのではないでしょうか。そういう意味では昔読めた(反応をすませた)サンプルがあれば、機械の調子が診断できます。 反応溶液を作成するために使った水がに阻害物がコンタミしていたなら、PCRまシーンがOKでも、きっとの溶液がOKでも反応はうまく行かない可能性もあります。 また最初のシグナルが出るまでの時間が極端に今までと違うとゲルやキャピラリーのあたりは怪しいです。そうでないならレーザーの劣化、ゴミなどがレーザー光を妨げてないかとか、キャピラリー装着の時の位置がレーザー光からずれているなどまシーンにもよりますが可也チェックポイントがありますよね。

(無題) 削除/引用 No.692-3 - 2011/07/21 (木) 03:11:18 - 310 そりゃ様とかぶるかもしれませんが、機種名、ポリマー、キャピラリなどの情報を教えていただくと、皆様の想像の助けになるかもしれません。 それ以外の点として、自身が使っている310だと思い浮かぶのは 、 キャピラリ交換後シーケンサーのキャリブレーションは行いましたか？ ゲルのリーク（白色固形の物質が、シリンジやキャピラリなどの継ぎ目に出る）はありますか？ シーケンス反応後の精製はどうされているでしょうか？ など、お教えください。

(無題) 削除/引用 No.692-2 - 2011/07/20 (水) 22:57:06 - そりゃ シークエンサー本体（特にゲル）の状態は？

シークエンシング 削除/引用 No.692-1 - 2011/07/20 (水) 22:46:05 - TH つい最近になってシークエンスが汚くて読めずに困っているものです。(Nが多く、ピークは重なり、高さも低い状態です) Big dye cycle sequencing kits に同梱してあったポジティブコントロールを使用してもだめで、Premixを新しく調製したものでもダメでした。ホルムアミドも新しいものを使いましたがダメです。PCR装置は故障してそうにありません。 あと原因は何が考えられるでしょうか? 助けてください。。。

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