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(無題) 削除/引用 No.691-19 - 2011/07/22 (金) 14:03:53 - あいう >手持ちのHis-tag抗体で、何も検出できなのですよね。 >万がいち、抗His-tag抗体だと思っていたのが、His-tag付きの何とか抗体だった、なんて事はないよねぇ。 弱い人間なので、もし私がこんな事を言われたら、自信が無いときは逃げ出してしまいそうです。 >Ｎ末端側に６×Hisを付加した時は普通にトランスファーされていました。 とありますので、N末に6xHisを付加したタンパクでは、手持ちの抗His-tag抗体で検出できたのではないでしょうかねぇ？ また、ポジコンとなるサンプルもあるようですので、6xHisを持つ二種類以上のタンパクを検出可能と言うことではないでしょうか？この場合、使っている抗体は抗His-tag抗体である可能性が高いと思います。

(無題) 削除/引用 No.691-18 - 2011/07/22 (金) 13:57:40 - 月詠 抗His-tag抗体の中には、C末端に付加されているHis-tagを認識性が低いクローンも市販されていますので、本件の現象は、おそらくお使いの抗His-tag抗体が、C末端に付加されているHis-tagを認識していないためだと思われます。 宣伝をするわけではないですが、下記メーカーの資料などを参考にして、抗体を変えるしかないと思います。 https://ruo.mbl.co.jp/catalog/img/pdf/142191anti_His_tag_OGHis.pdf

(無題) 削除/引用 No.691-17 - 2011/07/22 (金) 11:39:14 - qq 手持ちのHis-tag抗体で、何も検出できなのですよね。 タンパクの発現誘導はCBBで確認できているのですよね？ 空ベクターは、His-tagタンパク質を発現しないのですか。 抗体のメーカーに聞くのが一番ではないでしょうか？ 万がいち、抗His-tag抗体だと思っていたのが、His-tag付きの何とか抗体だった、なんて事はないよねぇ。

(無題) 削除/引用 No.691-16 - 2011/07/22 (金) 10:10:11 - おお 実はCBBで精製前のライセートでドカンと出てくるクローンをとってきて、実はそれは大腸菌で本のタンパクが毒性があるために微妙にとランケートされてたりした変なクローンで、みかけトータルのライセートで発現していないように見えるものが本当のクローンであるというオチがついているってことはないですか?

(無題) 削除/引用 No.691-15 - 2011/07/22 (金) 07:05:51 - ら 大腸菌内在蛋白が怖いので、昔いたラボでは、ペプチドシーケンサで目的物かどうか確認していました。今やるならペプチドマスフィンガープリンティングでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.691-14 - 2011/07/22 (金) 02:21:07 - NiNTAAP 笑い男様へ 良いアイデアだと思うのですが、もしかしたらKH2PO4様の実験目的とは会わないかもしれませんね。 たぶん、ゲル内染色試薬ってNiNTAに蛍光が付けてあったりするものですよね。KH2PO4様はNiNTAで精製したタンパクをウエスタンで確認しようとしているようです。NiNTAに吸着したタンパクをNiNTAで染めるのでは、違う面からの6xHis-tagの確認にはならないんじゃないでしょうか？ 大腸菌？内でちゃんと発現しているか確認のためのウエスタンであればゲル内染色はとても良い方法じゃないかなと感じます。

試してみるのも手では 削除/引用 No.691-13 - 2011/07/21 (木) 23:19:41 - 笑い男 　抗体を使わないHis-tagの染色試薬を使ってみるとか？ 抗体のN末/C末認識能の問題とかは少なくとも解決できるかも。 しかもゲル内で染色すれば、転写のトラブルとかも回避できるので。 染色試薬の感度は解りませんが、CBBで染まる量があるなら大丈夫では？

(無題) 削除/引用 No.691-12 - 2011/07/21 (木) 19:36:42 - ＣＢＢ ふ〜ん。ちょっと面倒かもしれませんが、わたしなら、タグを変えるのが一番早いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.691-11 - 2011/07/21 (木) 19:18:15 - カイ 以前いたラボの人が同じような状況になっていました。 同じ位置に（Nだったと思いますが）Trx-Hisタグをつけ、同じように発現してもタンパクA（上司からのポジコン）はきれいに発現してCBBで染まり、ウェスタンでもばっちり出るのに、タンパクB（彼の調べたいもの）は同じくらいきれいに発現してきれいに精製されCBBで染まるのにウェスタンではさっぱり出ない。 テクニカルな問題なのか、それはちゃんとタンパクが取れてるのか？ノンスペのコンタミじゃないのかと散々責められてましたが。 最終的に、サンプルバッファーを入れた後のボイルをしたほうがいいとか、しないほうがいいとか、βメルカプトエタノールはどれだけ入れたほうがいいとか、いろいろやってましたが、 「タンパクによって、いくらサンプルバッファー内で変性させて抗原部位を露出させようとしたところで、解け切れないコンフォメーションがあったり中のアミノ酸の荷電があったり云々で、Hisタグが認識されにくいものがあるんだ」 というような結論に達していたように思います。 私は他の研究グループなので、彼と上司のやり取りは基本的にノータッチで見ていただけなので、彼の結論が正しいかどうかもわかりませんが。 免疫染色なら固定方法によって抗原部位の露出が云々は考慮に入れるかと思いますが、ウェスタンのサンプルバッファー内なら全部露出してるんじゃないの？と思っていたのでマユツバですが、 ボイルするかボイルしないかなどの工夫で、一応見えるようになったようですよ。 ただ、ポジコンのAと同じ量（CBBで）乗せても、ウェスタンでの検出は1／１０に見えるとか、そんな感じでしたけど。

(無題) 削除/引用 No.691-10 - 2011/07/21 (木) 15:39:00 - ふぁいと >ラボの他の人も同じ状況 これはN末でしたか？C末でしたか？ 使っている抗His-tag抗体のデータシートは確認されましたか？（ここで製品名を出すのはあまり良くないかもしれませんね） >活性測定ができず、CBBかウエスタンでしか検出できません。 ウエスタンで検出できたならOKじゃないですか？ 頑張ってください

(無題) 削除/引用 No.691-9 - 2011/07/21 (木) 11:01:44 - KH2PO4 >[Re:7] ＣＢＢさんは書きました : > ＣＢＢでの発現チェックが間違いであったというのが私の周りでは非常に多いので注意を要すると思います。活性その他でチェックできていないのなら。 CBBでの発現チェックの間違いも可能性が高いと思います。しかし、活性測定ができず、CBBかウエスタンでしか検出できません。また、酵素活性が確認できているサンプルについてもウエスタンで検出できませんので困っています。

(無題) 削除/引用 No.691-8 - 2011/07/21 (木) 10:12:01 - もくもくさん >> これ（未精製）をウエスタンするとどうなりますか？ >未精製のものも検出されませんでした。 たんに目的産物-Hisのタンパク質が発現していないだけでは？ カラムについてきたのは非特異産物では。

(無題) 削除/引用 No.691-7 - 2011/07/21 (木) 09:54:22 - ＣＢＢ >ウエスタンを行う場合、ドットブロットを用いて抗体量を決定するのが一般的なのでしょうか？ いいえ、たぶん違うでしょう。私は、単に使う濃度を差し支えない範囲で最高にするだけです。 ＣＢＢでの発現チェックが間違いであったというのが私の周りでは非常に多いので注意を要すると思います。活性その他でチェックできていないのなら。

(無題) 削除/引用 No.691-5 - 2011/07/21 (木) 04:48:09 - ab すでに指摘されてますが、N末とC末では抗体の認識性がかわるので、N末のHis-tagを認識できてもC末のHis-tagを認識できないとしても不思議でないです。 抗体のデータシートを確認してみてはどうでしょう。 あと転写できているかが心配であれば、トランスファーした後のメンブレンをよく見ると、光の加減で転写されたタンパク質のパターンが見れます。CBBで見えるくらいの量であれば、十分見えます。染色の手間がいらないので、確認するだけなら楽です。 もしくは、転写した膜をCBBで染める事もできます。若干感度は悪いので、ラボで使用しているならポンソーSとかの方がよいかもしれないです。

(無題) 削除/引用 No.691-4 - 2011/07/20 (水) 21:18:44 - KH2PO4 > これ（未精製）をウエスタンするとどうなりますか？ 未精製のものも検出されませんでした。 > このタンパク質のみがカラムに吸着したかどうか？はまだ分かりませんよ。 これもCBBで確認しました。 ウエスタンを行う場合、ドットブロットを用いて抗体量を決定するのが一般的なのでしょうか？

こんな可能性は？ 削除/引用 No.691-3 - 2011/07/20 (水) 21:18:36 - NiNTAHRP 引用です >種抗Hisタグ抗体の認識配列が、Hisタグそのものに加え、各メーカー発売のベクター由来のHisタグ前後の配列を認識するようにデザインされているケースもあるので注意が必要である。 http://www.pssj.jp/archives/Protocol/Purification/NTA_01/NTA_01_01.html

(無題) 削除/引用 No.691-2 - 2011/07/20 (水) 21:00:41 - ＣＢＢ >発現誘導後、ＣＢＢ染色により、発現産物と思われるバンドが検出されたため、 これ（未精製）をウエスタンするとどうなりますか？ ＞このタンパク質のみがカラムに吸着してきため、これが発現したタンパク質と思いました。 このタンパク質のみがカラムに吸着したかどうか？はまだ分かりませんよ。

CBB染色とウエスタンブロットで結果が違う 削除/引用 No.691-1 - 2011/07/20 (水) 20:39:12 - KH2PO4 いつも勉強させてもらってます。 ウエスタンブロットでのバンドが検出されない事についての質問です。 とあるタンパク質についてC末端側に6×Hisを付加して発現を行いました。発現誘導後、ＣＢＢ染色により、発現産物と思われるバンドが検出されたため、次にＮｉカラムで精製を行いました。すると、このタンパク質のみがカラムに吸着してきため、これが発現したタンパク質と思いました。 しかし、His-tag抗体を使ってウエスタンブロットを行ったところ、目的のタンパク質はバンドとして検出されませんでした。CBB染色では検出できるのに、ウエスタンブロットでは検出できないという事はあるのでしょうか？ポジコンとして使用したタンパク質はきちんとウエスタンブロットで検出されました。 タンパク質自身が膜にトランスファーされにくいのでしょうか？発現系は異なりますが、Ｎ末端側に６×Hisを付加した時は普通にトランスファーされていました。 気になる事として、最近ラボの他の人も同じ状況で、タンパク質は発現しているがウエスタンブロットではバンドが検出できないという状況が続いています。 このような経験がある方、もしくはアドバイス等ございましたら、よろしくおねがいします。

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