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(無題) 削除/引用 No.688-10 - 2011/07/24 (日) 05:12:59 - おお たしかにお示しのような実験ではゲノムにあった方がいいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.688-9 - 2011/07/23 (土) 21:49:21 - 通り係 アンピシリン耐性が話をややこしくしている可能性があるので、それ以外の、カナマイシンとかの耐性のプラスミドを使ったどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.688-8 - 2011/07/23 (土) 12:59:39 - あ バクテリアの顕微鏡とfacsでのトレースが目的です。 発現しなくなった菌の割合が高いと、感染した細胞としていない細胞が区別できなくなってしまうので、できるだけ均一にするためにインテグレーションできないかな、と思っていました。 シングルコロニーから対数増殖期の早い段階で回収しても、発現していない（か、発現しなくなった）菌が結構多くて、アンピシリンを増やしてごまかしています。。今のところ３桁まではいかないと思いますので、まずは教えてくださった論文を読んでみます。

(無題) 削除/引用 No.688-7 - 2011/07/20 (水) 15:28:41 - おお >トランスフォーメーションとシングルコロニーの繰り返しと、 たぶんおわかりとおもいますが、シングルコロニー拾うために毎回トランスフォーメーションの必要はないですね。

(無題) 削除/引用 No.688-6 - 2011/07/20 (水) 10:37:14 - ~ その株で何をやりたいのかが書かれていないので、どのような手法が適しているのかが想像しにくいのですが。 物取りではなく、菌のトレース用などに蛍光を用いているのでしょうか。その場合、発現量自体にはそれほど意味を持たせていないのでしょうか。 >やはり相同組換えかトランスポゾンが必要なのですか。 必須ではなく、効率を高め、導入部位を選択できるようにするための選択になるとおもいます。 >複製開始点をつぶしてエレクトロポレーションすれば、どこかに適当に入ってくれないかな、と期待してました。。。 ターゲティング関係の論文を探せば、random integrationの頻度が見つけられるかもしれません。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC179407/pdf/1795380.pdf がずれてはいますが、関連する内容かと思います。（どのたんぱく質が組換えに関与しているかという意味で） >どちらが手間が少ないかな 今の予定ではトランスフォーメーションは何桁くらいの回数行なう予定なのでしょうか？ 3桁以上であれば、多少手間がかかっても、目的配列をゲノムに挿入した株を作ったほうが手間が少なくなるかもしれません。 また、おお　さんが書かれているように、 いったんグリセロールストックなどを作っておいて、使用前にプレートにストリークして、GFPが発現している株を選んで拡大培養すれば、トランスフォーメーションの回数が減らせるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.688-5 - 2011/07/19 (火) 20:07:03 - あ やはり相同組換えかトランスポゾンが必要なのですか。 培養細胞とリニアライズしたプラスミドのように、複製開始点をつぶしてエレクトロポレーションすれば、どこかに適当に入ってくれないかな、と期待してました。。。 発現量の方は、1／10になっても大丈夫と思いますが、トランスフォーメーションとシングルコロニーの繰り返しと、プラスミド作り直しのどちらが手間が少ないかな、というところです。

(無題) 削除/引用 No.688-4 - 2011/07/19 (火) 16:43:01 - ~ ゲノムへ組み込むには、ターゲティングの手法を用いる方法があります。 ただ、ターゲティング用コンストラクトを作ることになるので、多少は手間がかかります。 また、リコンビナーゼ発現大腸菌株を使ったりしますので、今の手持ちの菌株もそのままでは使えないかと思います。 （リコンビナーゼ発現ベクターを導入すれば使えるかもしれませんが） また、発現ベクターであれば10~数十のコピー数が稼げますが、ゲノムに入れるのであれば1~数コピーになるでしょうから、発現量も1/10かそれ以下くらいになるかもしれません。 1点目に挙げた内容は簡単のうちに入って、2点目に挙げた問題点は実験の目的に反しないでしょうか？ 問題ないようでしたら、市販品だとRed/ET Recombination Systemが売られていますので、調べてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.688-3 - 2011/07/19 (火) 16:17:46 - おお プラスミドを線上にした時にoriをつぶしたりとかいうのもありますし、コンディショナルなoriもあって、そういうのを使ってゲノムにインテグレーションするようなシステムもありますし、 そんなこと分かってないのかと責立てても質問の回答にはなりませんでしょう。 ゲノムにインテグレーションする方法はあるようです。いんてぐれーすなどをつかって相同組み替えするといった手法もあるようですし、トランスポゾンを利用するとゲノムに入り込むこともあるでしょう。 プラスミドをこうせい物質で維持していても、液体などで増やしていくかていで発現しにくくなるということですよね。毎回増やす前にシングルコロニーを拾うとどうでしょうか。発言しているコロニーはありますか? あとゲノムにいれて、この問題が解決するかというと、それに関しては自信がありません。大腸菌が邪魔なものを落としていると考えれば似たようなことが起こりそうな気がします。 ただし、バクテリアのこのような手法に関してはあまり知識、経験がありませんので、もっと詳しい方の意見が聞けると良いですね。

(無題) 削除/引用 No.688-2 - 2011/07/19 (火) 15:48:29 - ？ ゲノムに組み込むって・・・ プラスミドって大腸菌にとって何？ 継代のとき、薬剤によるセレクションは？

大腸菌安定発現株 削除/引用 No.688-1 - 2011/07/19 (火) 13:15:35 - あ GFP等を発現する大腸菌その他のバクテリアを使っています。 発現プラスミド（T7-GFP,tac-GFP)をトランスフォーメーションするとIPTGなしでも強い蛍光を出しますが、二、三回の継代で発現していない菌がほとんどになってしまいます。 毎回トランスフォーメーションしているのですが、線状にしたプラスミドを染色体に組み込むなど、安定発現株を作ることは簡単ですか？ それと、染色体に組み込んだ場合でも継代を続けると発現しなくなってしまうでしょうか。

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