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不安定な発現タンパクの安定化 トピック削除
No.686-TOPIC - 2011/07/18 (月) 20:26:27 - なでしこ優勝
哺乳類培養細胞を用いて、タンパク質の結合（IP)実験を行っております。
目的タンパク質の結合領域を100アミノ酸ほどまで狭めました。
さらに領域を狭めるために、短いトランケートタンパク質を作成（30アミノ酸ほど）しているのですが、この100アミノ酸もこれを分割した30アミノ酸も発現量がかなりよくなく、実験の結果が微妙です。（この領域はドメインを形成するという情報はありません）ちなみにこのタンパク質の全長はとてもよく発現します。

他のタンパク質の同じぐらいの長さのタンパク質はちゃんと過剰発現が見られます。しかしこのタンパク質はlysateをWBしてギリギリ見えるレベルです。
タグもMyc, HA, GFPなど試しましたが、どれも発現がよくないです。

原因を知るために、ユビキチンされたのかどうかをMG132を用いてWBしましたが、ユビキチン化されているようではありませんでした。

なんとかして、このタンパク質断片を安定化して、十分な発現量で実験を行いたいのですが、トランスフェクションしたタンパク質を安定化させる方法などご存知であれば、ご教授願えないでしょうか？
それともしょうがないですかね。
よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.686-7 - 2011/07/19 (火) 22:09:12 - おお
>[Re:4] おおさんは書きました :

> いろんなプロテアーゼをガンガンに入れることができますから場合によってはやり安いかもしれません。
>

いろんなプロテアーゼいんひびたーを。。。
訂正しておわびもうしあげます。

(無題) 削除/引用
No.686-6 - 2011/07/19 (火) 20:34:35 - なでしこ優勝
皆様コメントありがとうございます。
原因が不明である以上、簡単に安定化させる方法はなかなかなさそうですね。

リコンビナントを用いてプルダウン実験を検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.686-5 - 2011/07/19 (火) 10:38:40 - う
＞タグもMyc, HA, GFPなど試しましたが、どれも発現がよくないです。

タグに対する抗体で検出した結果、あまり発現していないというのであれば、
それはそういうものであると考えて、他の方法を試すのは早いと思います、個人的に。

お金はかかるかもしれませんが、

ペプチドを合成して競合させたら結合しない、

という実験系を組んだ方が早いと思います。

(無題) 削除/引用
No.686-4 - 2011/07/19 (火) 07:57:08 - おお
Y2Hをつかう。
どんどん削っていくのでなく、その30aa位の配列をデリートした残りを含むコンストラクトをつくるとか。

安定性という意味でその配列がターゲットになっているなら、その配列を含むたんぱく質が比較的多く発現している細胞を選ぶと、そういう細胞は分解するシステムがあまり活性化していないであろうという推測もできますので、実験に有利かもしれません。

あとはリコンビナント同士で結合実験をする。その30aaのアミノ酸をリコンビナントまたは合成で作りライセイトと混ぜてプルダウンするならいろんなプロテアーゼをガンガンに入れることができますから場合によってはやり安いかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.686-3 - 2011/07/19 (火) 05:30:24 - yyy
立体構造上の問題がなくて配列の問題だけなら、ありふれた方法かも知れませんが、別のタンパクとの融合蛋白を作るのはどうでしょうか？　コントロールをしっかりとる必要はありますが。スペーサーを十分に取ってN末C末につければ発現は大丈夫な気がします。
本来結合しないタンパクが結合してIPで落ちてくるならそれはポジティブととれると思いますが、要求されるエビデンスのレベルはそれ以上なのでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.686-2 - 2011/07/18 (月) 21:05:58 - なでしこ
発現が悪いものを改良するのは難しいことがあるので、そこまでやったのなら標的部位をデリーションするか、E.　coliでの発現にもっていくかということも考えられます。

不安定な発現タンパクの安定化 削除/引用
No.686-1 - 2011/07/18 (月) 20:26:27 - なでしこ優勝
哺乳類培養細胞を用いて、タンパク質の結合（IP)実験を行っております。
目的タンパク質の結合領域を100アミノ酸ほどまで狭めました。
さらに領域を狭めるために、短いトランケートタンパク質を作成（30アミノ酸ほど）しているのですが、この100アミノ酸もこれを分割した30アミノ酸も発現量がかなりよくなく、実験の結果が微妙です。（この領域はドメインを形成するという情報はありません）ちなみにこのタンパク質の全長はとてもよく発現します。

他のタンパク質の同じぐらいの長さのタンパク質はちゃんと過剰発現が見られます。しかしこのタンパク質はlysateをWBしてギリギリ見えるレベルです。
タグもMyc, HA, GFPなど試しましたが、どれも発現がよくないです。

原因を知るために、ユビキチンされたのかどうかをMG132を用いてWBしましたが、ユビキチン化されているようではありませんでした。

なんとかして、このタンパク質断片を安定化して、十分な発現量で実験を行いたいのですが、トランスフェクションしたタンパク質を安定化させる方法などご存知であれば、ご教授願えないでしょうか？
それともしょうがないですかね。
よろしくお願いします。
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