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(無題) 削除/引用 No.685-9 - 2011/07/19 (火) 02:44:33 - 310 もしCmが失活しているようであれば、今後も問題になるでしょうから、新しく用意したCmで寒天培地、あるいは液体培地をつくり、植え継いで、生えてくるか見るのもひとつの手です。寒天培地はうまく区画すれば、1枚で60コロニー程撒けますし、液体培地も多めにサンプルを準備して、増殖がいいのだけミニプレップしても良いと思います。 たくさんのクローンが信用の置ける寒天培地で生じ、数百程度のコロニーを調べたければコロニーPCRで調べてもいいのでしょう。調べるコロニーが多すぎで大変ならば、コロニー溶液をプールしてからPCRをかけても良いのではと思います。私は自分の実験の都合で100程度のコロニーをスクリーニングすることが多いですが、このくらいからは、明らかにコロニーPCRの効率が上回ります。24個程度（うちの1.5ml用遠心機の限度）でプラスミドが後で必要な場合、効率はミニプレップとあまり変わらないでしょう。各々のラボでルーチン化している方法を使うのが、楽だと思います。

(無題) 削除/引用 No.685-8 - 2011/07/18 (月) 09:46:21 - Harmonia 検証中ということですから、待ちますが、コロニーPCR は、このフォーラムでたびたび質問が出るように、結果の出方が不安定なので、プラスミドを抽出して、確かめたほうがいいと思います。

サイズも気にしてます 削除/引用 No.685-7 - 2011/07/18 (月) 03:49:59 - 東北大好き 印象ですが、小さめのコロニーが目的のInsertを持っている場合がしばしばあります。明らかに大きなコロニーは、ベクターのみのことが多くて。 でもそう思っていたら、全く逆で、始めに拾った小さな6個が全部ベクターのみだったのに、大き目のを次回に拾ってその中に沢山ポジティブがあった、という経験も、一度ですがありました。 形質転換が大腸菌の増殖速度に何らかの影響を及ぼしていた可能性を考えています。 小さ目のコロニーを多めに拾い、大きいもの、中間的なものも 取り混ぜて拾っていますが、一定の傾向が推定される場合があるようです。

(無題) 削除/引用 No.685-6 - 2011/07/17 (日) 16:57:55 - 月詠 無数（計測不能）と概算でも100〜1000と計測できる場合では導かれる結論も変わってきますので、観察結果はなるべく詳細かつ精緻に表現する癖をつけられた方がよいと思います（科学者として）。 コロニーが極小で無数なのであれば、選択用の抗菌剤の失活が考えられます。 コロニーサイズが小さくて100-1000個であれば、抗菌薬が微妙に失活してしている（中途半端に作用している）とか、ベクターの脱リン酸化処理等が不完全でセルフライゲーションが多い等の可能性が示唆されます。 コロニーが明瞭なサイズであれば酵母のコンタミネーションの可能性も考えられます。 いずれにしても、テキスト通りに対照実験をきちんとおけば鑑別できるエラーの類だと思います。

(無題) 削除/引用 No.685-5 - 2011/07/17 (日) 09:15:08 - mp もしかすると、 >このまでの実験から、 >当方の条件で、24時間後、1枚のプレートに1-10程度程度のコロニーが生じるはずなのですが、 というのは、Ligation反応直後のプラスミドの形質転換の結果で、 今回の、 >同条件で先日播いたプレートに、無数（100-1000個／枚）のコロニーが生じてしまいました。 >よく見ると、無数ある中に1つだけ他よりも大きなコロニーがありました。 というのは、Ligation反応を経ていないプラスミドの形質転換の結果でしょうか？ そうなると、見かけ上の形質転換効率が違うのは普通なのですが・・・。

(無題) 削除/引用 No.685-4 - 2011/07/17 (日) 09:01:41 - AP 抗生物質が効いていないなら100個とか1000個とか、数えられるレベルではなく、個々のコロニーを判別することのできない一面のlawnになると思います。 electroporationのコンピーテントセルは10^10 cells /mLくらいだと思いますが、SOCを加えた状態で1 uL播いてただけでも、十万〜百万細胞のオーダーになるはずです。

(無題) 削除/引用 No.685-3 - 2011/07/17 (日) 01:41:05 - おお Possible contamination of yeasts.

(無題) 削除/引用 No.685-2 - 2011/07/17 (日) 01:24:19 - 桑 この実験に使ったプレート（Cm含有LBプレート）をまだお持ちでしたら、形質転換させていない大腸菌をそのまま播いてみたらいかがでしょうか？ それでもコロニーが生えてくるようでしたら、それはCmが失活しているんだと思います。この場合はプレートを作りなおして、実験を再度やり直した方がいいでしょうね。 見た感じサイズの大きなコロニーをひろうことは個人的にはあまりしないです。複数が融合して一つになっている可能性を否定できないからです。周囲と比べて平均的な大きさで、かつシングルコロニーとしてひろえるものをいつも使っています。

大きさの異なるコロニーが同時に生じてしまう 削除/引用 No.685-1 - 2011/07/16 (土) 21:47:29 - nami 目的プラスミド（Cm耐性）を大腸菌にエレクトロポレーションし、 Cm含有LBプレートで目的形質転換菌をセレクションしています。 このまでの実験から、 当方の条件で、24時間後、1枚のプレートに1-10程度程度のコロニーが生じるはずなのですが、 同条件で先日播いたプレートに、無数（100-1000個／枚）のコロニーが生じてしまいました。 よく見ると、無数ある中に1つだけ他よりも大きなコロニーがありました。 印象としては、抗生物質が効いておらず、形質転換していない「空」の菌が無数に生育してしまっていて、 他よりも大きなコロニー1つだけが目的プラスミドを持っている、ような気がするのですが、 ご経験者におかれましては、どのような印象をお受けになられるでしょうか？ 経験談など含めてご意見をいただけないかと存じます。 よろしくお願いいたします。 （実験としては、今後コロニーPCRで得たコロニーが目的プラスミドを持つか診断する予定です）

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