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(無題) 削除/引用 No.684-14 - 2011/07/20 (水) 13:14:34 - AP 私の材料はマウスではないので、参考程度の話です。 私は抗体を作りたいとき、まずマウスでポリクロを作ってみます。 マウスだと、一匹あたり血清量が1 mL弱しかとれないところが欠点ですが、それだけあれば、一通りのWesternや染物ができ、それでデータが十分そろってしまうことも少なくないです。また、先々の実験のためウサギ血清やモノクロが必要な場合も、コストや時間のかかることですし、マウスポリクロを作成し、実績があがった抗原や方法を踏襲することで、失敗のリスクを下げます。 マウスポリのメリットは、 ・早い。最低2回の免疫でいいので最速、一ヶ月でとれる。 ・安価で、飼育ハンドリングがしやすいので、外注などせず自前でもできるし、免疫個体数、5−6匹くらいはたやすい。個体ごとのロット差の比較によって、結果の判断がしやすい。 ・ウサギと違って、高度に近交化されており、市販のものはSPFが普通なので、個体差が少ないし、変な抗体をもっていたりしない。たとえば、コントロール用の免疫前血清でウェスタンをすると、ウサギだとそれだけでいろいろバンドがでて、しかもそのパターンが個体ごとに違ったりするが、マウスだとあまりそういうことがない。バックグラウンドがきれいなので、どれが本物のバンドだか判断しやすいし、アフィニティー精製なしで使えることが多い。 概して、コストや時間のかかるプロジェクト始める前の、パイロットプロジェクトとして好適な性格だといえます。 ただし、今回は相手がマウスなのでマウスで抗体を作るのはいろいろ差しさわりがありますね。 かわりにラットを免疫するとか（これも種が近すぎてうまくないのかしら）？

(無題) 削除/引用 No.684-13 - 2011/07/20 (水) 00:41:44 - awa 詳しいアドバイスありがとうございます。 Flagを使った実験系は非常に分かりやすく、試してみる価値が十分あるように感じます。逆に、思い切って抗体作製をして染めてみても、染まらなかったときにどう解釈していいのか分からないという不安もあります。時間をとるか確実性をとるかといった感じになるんでしょうが、悩んでいても時間だけ過ぎていくので前向きに検討したいと思います！ ただ、翻訳抑制とかの要因でタンパク発現が無かった場合が恐いですね、いきなり抗体作って染まらなかった場合。。

(無題) 削除/引用 No.684-12 - 2011/07/19 (火) 22:40:10 - Harmonia No.684-4 の補足 哺乳動物細胞にCMVベクターで目的遺伝子を発現させても、CBB染色で見えるほどの発現は期待できません。大腸菌発現系なら、期待できますが。 なので、抗体で特異的に検出する方法が必要です。 一方、いま、その遺伝子の抗体がないのですから、何らかタグを目的遺伝子産物に付け、抗体でタグを検出する必要があります。 「FLAGタグつきで目的遺伝子を発現させ」は、抗体で検出するためにタグが必要だからで、 「見えれば」は、発現させたタンパク質にPESTとか何かタンパク質が壊れたり切れたりする配列があるとか、翻訳抑制があるとか、いろんな要因で「見たいものが見えないことがある」ためです。見えないなら、そもそものその遺伝子産物も、観察しにくいことが予想できます。 うちで取り組んだ遺伝子も、その手法で見えなかった部類です。 コーディング内に翻訳抑制とかタンパクぶっ壊しの暗号が隠されているのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.684-11 - 2011/07/19 (火) 16:22:53 - おお >[Re:10] awaさんは書きました : > ORFをベクターに入れるなどの実験はまったく無知だったため、そういった実験系で確率を上げるということも考慮してみます。むしろ時間が許すのであればこういった実験も練習して身につけたいと思います！ ORFだけでは解決しませんので、慎重にデザインしてください。あとたんぱく質が存在しているかどうかを抗体を得る前にやった実験とか複数パぶりッシュされてます。是非調べてみてください。

(無題) 削除/引用 No.684-10 - 2011/07/19 (火) 15:38:34 - awa 様々なご意見ありがとうございます。抗体作製を考えてはいるものの、遺伝子を見る以外にも補足的な実験はないかと考えていました。しかし急ぎの実験ということもあり、一度ボスと相談してみます。 ORFをベクターに入れるなどの実験はまったく無知だったため、そういった実験系で確率を上げるということも考慮してみます。むしろ時間が許すのであればこういった実験も練習して身につけたいと思います！

(無題) 削除/引用 No.684-9 - 2011/07/19 (火) 09:57:09 - ~ >タンパク発現もあるという仮定で抗体作製までいってもいいものなんでしょうか？ In vivoで存在しているか分からなくても抗体を作る人はいますので、 今のデータで抗体作製まで行くかどうかはラボの方針（や懐具合）次第かと。 ただ、これ以上どのようなデータを求めているのでしょうか？ そろそろたんぱく質側を見るころあいだと思いますが。 >RT以外にもタンパク発現が見られるか推測できるような実験 抗体無しでたんぱく質の発現を見るのであれば、2D-PAGE→銀染→LC-MS/MSによるたんぱく質の定量と定性もあります。ただ、修飾が分からないとかなりたくさんのスポットを見ないと目的たんぱく質の確認が出来ないでしょうし、目的たんぱく質が複数のスポットになる場合もあります。 近所のラボに消耗品代のみで御願いできるなどでないと、外注になれば抗体作製よりも高くつくでしょう。

(無題) 削除/引用 No.684-7 - 2011/07/19 (火) 09:19:32 - なんとも 私なら、個人的に面白いと思えば、積極的にやりますね。 アメリカなら、３００ドル以下でウサギ抗体を作れるところがあります。（やらないなら、むしろ怠慢という印象を持ちます。）それだけクリティカルなステップではないでしょうか？ ペプチド抗体は最初は避けるべきでしょう。GST-100-300アミノ酸のフュージョンがいいかも。

(無題) 削除/引用 No.684-6 - 2011/07/19 (火) 04:46:14 - 310 以前、ボスから安く出来るからやってみないかと言われ、ペプチド抗原で抗体を作る機会がありました。ELISAでペプチドに反応する抗血清は容易にできますが、ウエスタンで目的のバンドを出すのはやや難しくペプチドカラムが必要だったり、ペプチドブロッキングで消えるけど本来のサイズと違うバンドを消すのは、困難でした。免染できれいに染まっても、ウエスタンでたくさんのエクストラバンドが出ていると、データとしては使えず、こまりました。しかし、抗ペプチド血清でウエスタンも免疫染色もきれいな結果が出たこともありました。 ペプチドの設計にはプロの方も加わったのですが、それでも上記のような激しい当たり外れがあります。同じラボの人からは蛋白の大きな部位や蛋白全体で免疫出来るなら、そちらの方が良いと言う意見が多くありました。ペプチドの短さでは、本来の立体構造の反映は困難だからというのがその理由です。 資金がたくさんあり、抗体作成を複数回失敗しても大丈夫であれば、ペプチド抗体も良いかもしれません。しかし可能なら、大きめの抗原を使った方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.684-5 - 2011/07/18 (月) 14:30:37 - おお >[Re:4] Harmoniaさんは書きました : > 予想ORF をCMV FLAG のベクターに入れて、培養細胞で発現させ、FLAGでウエスタンか染色して見てみる。 > 見えれば、抗体を作ることをストップさせる要因は減る。 これについてもう少し詳しく知りたいのですが、ORFだけをベクターにいれて、ベクターの能力で持って1stMetを読ませてしまえば人口的な配列でも場合によってはうまく発現するように思えるのですが、ORFとその上流を含んだものをベクターに挿入してORFが認識されるかを見るということも重要と思えますが実際お考えなのかと。 ----- RNAレベルで高発現している細胞を選ぶと、トランスフェ句ションでも比較的見易いかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.684-4 - 2011/07/18 (月) 10:11:46 - Harmonia うちでもポリクロやらモノクロやらいろいろ作った遺伝子があるけど、結局、CAGプロモーターで発現させるとか、SV40 oriのベクターでCOS-1細胞に入れるとかでないと、見えなかった。RNA はノザンでしっかり見えたけど。 翻訳されないヤツ、p53みたいに分解が激しいヤツなど、mRNA だけでは蛋白質量は語ることができません。 抗体作成はお安くないので、「作成しない」がデフォルトで、そこから「作成する」に踏み切るためにはどうするかを考えます、ぼくなら。 予想ORF をCMV FLAG のベクターに入れて、培養細胞で発現させ、FLAGでウエスタンか染色して見てみる。 見えれば、抗体を作ることをストップさせる要因は減る。 見えないとき、いろんなことが予想できる（壊れやすいタンパクとか）。そんときは、まだ抗体作成に踏み切らない。 一方、いまなら予算があって、使途が抗体作成でもよくって、他に使い道で優先させるものがない、というなら、作ります。 ところで、抗体を作るための抗原は、たっぷり手に入るの？ 例の遺伝子の場合、大腸菌で壊れやすく、それでもそれを抗原にモノクロを作ったら、「大腸菌内で壊れたその切り口」に対すると思しき抗体が取れ、でも本命は取れなかったことがあります。

(無題) 削除/引用 No.684-3 - 2011/07/18 (月) 09:01:43 - おお 種間で保存されてなくて、何かその種の特異せいなどが説明できるならそれもやってみる価値があるかもしれませんね。 タンパクはやはり抗体を使うのが早道です。違う方法も全くないとは言えませんが結果が出る(白黒がつく)しっかりとしたプロトコールになるかどうかも想像がつきません(可也厳しいだろうとおもえるプロトコールは幾らかは考えられます)。 その配列から想像されるORFが存在するかどうかという意味ではin vitro translationやなるべく発現しているだろうmRNAに近い形で過剰発現系を使う手はあるとおもいます(過剰発現はc末にタグを入れてin frameで読まれているかなどみるとまずはそのタンパク特異的な抗体はいりませんね)。 これでORFの存在を示唆することができれば抗体を作る意味は可也出てくるだろうと思います。 ノックダウンなどでタンパクがみれなくとも生理的な変化があるのであればそれはそれでいずれの方向にせよ意味が出てくると思います。

(無題) 削除/引用 No.684-2 - 2011/07/17 (日) 13:30:11 - なんとも なんとも言えないと思います。 その予想の蛋白が相同性などから、非常に重要であることが予想され、種を超えて保存されているのなら、やる価値はあるかもしれません。

抗体作製 削除/引用 No.684-1 - 2011/07/16 (土) 18:46:50 - awa 抗体作製のステップについて質問です。 現在ある遺伝子に注目しており、それが部位特異的な発現をしていることをRTで確かめました。RTはマウスを部位別に分けて調べており、個体の週齢もふって確かめました。 次に、この遺伝子が同部位でタンパク発現も見られるのか調べたいのですが市販抗体がありません。そこで抗体作製にいきたいと安易に考えていたのですが時間とお金がだいぶかかるため、RT以外にもタンパク発現が見られるか推測できるような実験があれば教えていただきたいです。 ちなみに目的遺伝子はRTだと30cycleではバンドが見て分かるぐらい出ます。ぎゃくにこれだけでタンパク発現もあるという仮定で抗体作製までいってもいいものなんでしょうか？抗体はポリクロ(ラビット)を考えてます。

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