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(無題) 削除/引用 No.683-9 - 2011/07/20 (水) 14:59:09 - KO 774様 済にもかかわらず、詳細なアドバイスありがとうございます。 実体験をお聞きすることが出来、非常に勉強になりました。 ・Short Armでの変異 ・変異あるいはstrainでの違い この点については、注意していきたいと思います。 我々の研究室にもKOD酵素が一式そろっておりますので、一度試してみたいと思います。 ありがとうございました。

済になっていますが・・・ 削除/引用 No.683-8 - 2011/07/20 (水) 00:00:27 - 774 参考までに。 targeting vectorの構成次第だと思います。 例えば、もしarmの構成がshort(1kb程度)・longだったとします。 この場合、shortの変異はクリティカルなはずです。 次に、もしshortが3kb等ある程度の長さでデザインしているのであれば多少であれば問題ないはずです。 ここで頭に入れておかないといけないのが、armのPCRに使うテンプレートはどのマウスのstrain由来で、そしてESはどのマウスのstrain由来であるのかという点です。(B6？129？等) 当然ES細胞で組み換えを行わせるわけですから、ES由来のゲノムを使用します。 そして、armをsequencingしてNCBI等のデータベースの配列と比較するわけですが、もしデータベースのstrainとESのstrainが異なっているのであればarmの変異は意味が異なってくる場合があります。 �@PCR等で本当に変異が入ってしまっている。 �AESのstrainではそうなっている。 �@の場合であれば、同じテンプレートを使用して２lineで実験を進めてsequencingすると変異の位置は異なってくるはずです。 �Aの場合であれば、2lineとも同じところに変異が入ってくるでしょう。 うちのラボは129のESを使用しているのですが、私が最近作製したKOの遺伝子はB6と比べると変異だらけでした。それでも2lineで同じ変異が見られたので気にせずベクターとして用いて、それを使用してエレポ・サザンも行いましたが問題ない結果を得ました。（まだマウスはいませんが・・・） ちなみに、酵素はKODシリーズを愛用しています。 plus-neoなどはPCRが走ればsequencingがいらないんじゃないかと思うほどです。心配なのでseqencingしますが・・・。 ↑あくまで個人的な感想にすぎませんのでご了承ください。

(無題) 削除/引用 No.683-7 - 2011/07/19 (火) 18:51:43 - KO おお様、ナリナリ様 アドバイスありがとうございます。 SNPsがたくさんある場合でも可能ということを聞き、安心いたしました。 とりあえず、数塩基の違いは許容範囲という理解で、進めて行きたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.683-6 - 2011/07/18 (月) 15:53:07 - ナリナリ ESとtargeting vectorにSNPsが沢山ある場合でも、うまくいった経験があります。効率もそれほど変わった印象はありませんでした。homology arm 6kbのうちの数bpですし。 targetingのデザインに支障を来さない様な少数のmutationは全く問題ないと思っています。 good luck

(無題) 削除/引用 No.683-5 - 2011/07/18 (月) 14:35:27 - おお >[Re:4] KOさんは書きました : > おお様、なんとも様 > アドバイスありがとうございます。 > > 相同組換えが起こる領域の塩基配列は１００％同じでなくても出来るということですが、実際にそういうことを経験された方はおられますでしょうか？ 直接回答がないのですが、ベクター構成用のゲノムライブラリーを作成したマウスの株と違うマウスでKOをやるといったこともあるようです。今かんがえればSNPsが何カ所かあっただろうなぁと。。。 経験者のレスがつくと良いですね。

(無題) 削除/引用 No.683-4 - 2011/07/18 (月) 14:26:56 - KO おお様、なんとも様 アドバイスありがとうございます。 相同組換えが起こる領域の塩基配列は１００％同じでなくても出来るということですが、実際にそういうことを経験された方はおられますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.683-3 - 2011/07/17 (日) 13:36:06 - なんとも ノックアウトの大御所が昔（いまは知りません）、PCRは絶対にやらない、ゲノミックから取ってくる。ミスマッチ蛋白が集まってくるので変異があるとまずいと言っていました。

(無題) 削除/引用 No.683-2 - 2011/07/17 (日) 01:48:27 - おお >１００％同じでなければいけないのでしょうか？ 全く同じでなくてもKOはできると聞いたことがあります。

ターゲティングベクターの塩基配列 削除/引用 No.683-1 - 2011/07/16 (土) 17:05:10 - KO 今度、ノックアウトマウスを作製する予定です。 現在、第一エクソンを飛ばすようなターゲティングベクターを作成しているのですが、PCRで増幅した第一エクソン前後の配列（相同組換え用の配列）にどうしても変異が入ってしまいます。 そこで聞きたいのですが、 ・相同組換えのための配列は１００％同じでなければいけないのでしょうか？ ・皆さんはPCRにどの酵素を用いていますでしょうか？ アドバイス頂ければ幸いです。

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