BioTechnicalフォーラム [アミノ酸配列を知りたい]

アミノ酸配列を知りたい

No.681-TOPIC - 2011/07/16 (土) 10:41:05 - LCMS

全長のタンパク質をトリプシンで消化した後、Ni-NTAでタンパク質精製し、活性を持っている20KDaぐらいのペプチド断片を取れました。このペプチド断片の全アミノ酸配列を知りたいです。全長のタンパク質がHistagをつけているため、Ni-NTAで取ってきたペプチド断片はN末端の最初からのはず。しかし、C末はどこまで切られているかは不明です。実はこのペプチド断片に含まれている活性触媒残基を同定するため、Ｃ末はどこまで切れれているかを知る必要があります。もちろんトリプシン切断サイトからある程度推測が可能ですが。正確な情報を欲しいです。SDS-PAGEからバンドを切り出しをして、ToF-MSやLC-MSをかけると、正確なアミノ酸配列が分かるのでしょうか。このあたりはまったくの未経験者なので、経験者の方のご意見をうかがえると幸いです。
また、分析受託会社に分析を依頼するつもりなので、どのようなサービスを受けられますか。手頃な値段で正確に分析できる会社も教えたください。

よろしくお願いいたします。
　

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No.681-10 - 2011/07/20 (水) 12:19:12 - こうじ

20kDaの既知配列ならMALDI TOF-MSで見てみるのはどうでしょうか。
消化産物のうちターゲットがメインバンドであれば
精製せずに溶液でも確認できると思いますが。

(無題)

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No.681-9 - 2011/07/19 (火) 13:29:15 - おお

分解後のタンパクのC末をビオチン化とかしてトリプシン処理、ぷるダウンし、それでもビオチンがついているペプチドをMSに持っていったほうが確実にC末が見れるのではないでしょうか。

生化学的には古典的な方法ではC末からペプチだーぜで遊離アミノ酸を同定する方法とかありますが、均一なものか、1、2種類のものがマジョリティをしめないといろいろなアミノ酸がでてきて分からなくなってしまうかもしれません。

精製したタンパクでその処理をしているなら、全長や活性がなくなるまで削れたタンパクでペプチドフィンガープリントをみて(完全トリプシン処理とかのあとで逆層で何ぼんペプチドが出て、活性のないフラグメントにも含まれるとか、全長に含まれるが20kDaの活性あるものには無いとか)あたりをつけてからそのペプチドを狙ってMSに持ち込む手もあるかもしれません。

(無題)

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No.681-8 - 2011/07/19 (火) 07:45:47 - LCMS

ご返信、遅くなってすみません。
皆様のごアドバイス、ありがとうございます。
補足ですが、既にdeletion mutationsのいくつかを作成しました。ところで、ｙｙｙさんご指摘したように、タンパク質のほとんどは不溶性になってしまいました。また、今回のタンパク質サンプルは全長タンパク質サンプルの活性反応をした後のトリプシン消化で、取れたペプチド断片はisotope labelling 実験で活性があることを確認済みです。本来ならば、LC-MSなどの方法で、直接修飾された活性残基（活性残基ーGMP）を決めたいところですが、何せ活性残基ーGMPのIntensityが低いため（１－５％ぐらい？）、以前行ったLCーMSの結果がいまいち分かりませんでした。以前は全長タンパク質を使いました。

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No.681-7 - 2011/07/19 (火) 03:33:16 - yyy

Inteernal delition mutantまたはtruncated mutantで活性のあるものが取れれば良いのでしょうから試してみる価値はあると思います。が、タンパクによっては、活性を持つ正しい立体構造をとるために他の部分が必要ということもあるので、そういう場合は活性が見られないかも知れませんね。
　

(無題)

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No.681-6 - 2011/07/18 (月) 04:25:19 - なでしこ

>ToF-MSやLC-MSをかけると、正確なアミノ酸配列が分かるのでしょうか。

最近やってもらいましたが、LC-MSですと、すべての領域がカバーできません。大量のサンプルでも。運がよければ、目的の領域をカバーできると言った感じです。前に示唆されているように遺伝子面でのアプローチがいいかと思います。

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No.681-5 - 2011/07/17 (日) 16:44:33 - 月詠

atsさんの方針に一票です。

最終的に酵素活性残基を証明するのが目的ということであれば、必ずしもこのトリプシン消化ペプチドのC末端領域を正確に決定しておく必要はないと思います。

（１）目的のペプチドは20kD程度（アミノ酸170残基程度）であること
（２）そもそもトリプシン消化末端を特定できたとしても、その後の酵素活性残基特定へのアプローチとして、いずれにしても、活性部位欠失クローンないしアミノ酸置換クローンにおける活性喪失を証明しなければならないこと
などを考慮すれば、最初から、予想されるトリプシン消化末端からさらに20～30残基程度づつ削ったdeletion cloneシリーズを作成して、どの領域まで削ると酵素活性が失われるのかスクリーニングする方が早道のように思います。
20kDであればcDNAでは約550bp程度ですから、N末側は同じプライマーで、C末側のプライマーをトリプシン消化残基から40～60bpづつ削る位置に設定してPCRで増幅してPCRクローニングすればよいでしょう。タンパク発現系は現在用いている系をそのまま流用できるはずです。

もし目的遺伝子の配列が不明なのであれば、アミノ酸配列決定を委託されるくらいならcDNA配列決定を委託される方がはるかに無駄がないと思います。

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No.681-4 - 2011/07/17 (日) 15:47:40 - ンンノ

島津製作所がC末端のアミノ酸配列解析の受託サービスをやってます。

ただ、質問の内容だと２０ｋDaのペプチドに活性があるかどうかは断言できない
ような気がしますが。

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No.681-3 - 2011/07/16 (土) 17:50:44 - AP

タグを含め全長のアミノ酸配列は既知なんですよね。
多くの場合、質量分析で精密質量を求めれば、既知の配列の断片の中で、その質量に一致する配列は一義的に決まると思います。たまたま一致する配列が複数考えられて一義的に決まらないときは、MS/MSでペプチドシークエンスを見てみればいいのではないでしょうか。

発現実験は？

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No.681-2 - 2011/07/16 (土) 12:04:44 - ats

クローン化されていると思いますので、トリプシン切断部位までの、短いORFを数種発現させてみてはどうでしょうか。
20kDaほどならGST融合タンパクとして大腸菌で発現させれば可溶性になるものが多いでしょうし、粗抽出液でも活性の有無くらいは測定できるのではないでしょうか。