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(無題) 削除/引用 No.680-3 - 2011/07/16 (土) 05:59:28 - Kanata > ほかの実験(IP：Flagで沈降)では、BSAを用いた検量線を引かないで > IP産物の吸光度を測定して、Sampleの中で一番低い吸光度に > ほかのSampleを希釈するという方法を用いていました。 > この方法で、タンパク量がばらついたことはありません。 > (Flagで検出してもバンドの濃さにばらつきがなかったため) 絶対量を測っているわけでもない状態で、バンドの濃さだけで「タンパク量がばらついたことはありません」ですか。おおさんがコメントされたように、抗体の量が同じだからばらついてないのでは、とも思いますが。 どういう分画バッファーを使っているのかわかりませんが、タンパク定量法によっては高濃度の塩や界面活性剤によってバックグラウンドが上がったり呈色反応が妨害されるものもあるので、よく検討することをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.680-2 - 2011/07/16 (土) 02:18:44 - おお >[Re:1] noさんは書きました : > ほかの実験(IP：Flagで沈降)では、BSAを用いた検量線を引かないで > IP産物の吸光度を測定して、Sampleの中で一番低い吸光度に > ほかのSampleを希釈するという方法を用いていました。 > この方法で、タンパク量がばらついたことはありません。 > (Flagで検出してもバンドの濃さにばらつきがなかったため) ちょっとこのことで不思議に思ったのですが これはIPした時に加えた抗体がマジョリティーを占めるとおもいます。また何を持ってばらつきがないとしたのかよく分かりませんけど。 まずご指摘のような疑問があるならすべてのバッファー系でスタンダードを置いてはかるのが普通のアプローチではないかと思いますけど。

細胞分画でのタンパク量の揃え方 削除/引用 No.680-1 - 2011/07/16 (土) 02:03:38 - no いつもお世話になっています。 初歩的な質問ですが、よろしくお願いします。 最近初めて細胞分画を行いました。 そこで、きれいに分画されているか、また、各分画での特定の因子の発現量の違いをwestern blotで確認したいと思っています。 そこで、どのような方法を用いれば分画間のタンパク量が揃えられますか？ ほかの実験(IP：Flagで沈降)では、BSAを用いた検量線を引かないで IP産物の吸光度を測定して、Sampleの中で一番低い吸光度に ほかのSampleを希釈するという方法を用いていました。 この方法で、タンパク量がばらついたことはありません。 (Flagで検出してもバンドの濃さにばらつきがなかったため) しかし、検量線を引いて濃度を測定したほうが正確にSample間のタンパク濃度を合わせられると思っているます。 もし検量線を引く場合、分画で用いているbufferが異なっているの場合 各分画で用いたbufferでBSAを希釈して検量線を書いて 各分画の濃度を出していくしかないのでしょうか？ 回答お願いします。

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