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(無題) 削除/引用 No.677-7 - 2011/07/20 (水) 10:19:14 - GITC QiagenのニュースレターでRNA中の230 nmの吸光度について言及したものが出てました。 http://www.qiagen.com/faq/faqview.aspx?faqid=2248 http://www.qiagen.com/literature/gexnews/pdf/2301700_nl_gef_15_0310j.pdf かいつまんで書くと、RNA溶液中の高い230 nmの吸光はほとんどの場合TRIzolなどに含まれるグアニジンチオシアネート（GITC）の混入が原因であること、GITCはサブミリモーラークラスの混入でも大きな260/230比の低下をもたらすこと、RT-PCRで確かめたところGITCの混入は100 mM（！）まで大きな影響をもたらさなかったことが述べられています。

(無題) 削除/引用 No.677-6 - 2011/07/20 (水) 05:07:38 - おお http://www.bio.davidson.edu/projects/gcat/protocols/NanoDrop_tip.pdf アルコールはUVなどのスペクトラムでは検出しにくいと聞いています。 EDTAを使ったバッファーであれば230nmの吸収は上がるので、EDTAを避けるのと、酸性に偏らないための工夫が必要です。酸性ではうまく図れません。

(無題) 削除/引用 No.677-5 - 2011/07/20 (水) 03:19:52 - 見習い 皆様、詳細な御回答ありがとうございました。 サンプルが少量であったため、ダメもとでqPCRに進めました。 その結果、260/230比が2.0に近いサンプルのヒトと同じ結果をえることが出来ました。 （RNA希釈にトリスは使っていませんでした） いずれにしても、ご指摘いただいた点に注意して、次回のRNA精製を行いたいと思います。 また宜しく御願い致します。

(無題) 削除/引用 No.677-4 - 2011/07/15 (金) 11:50:28 - 310 吸光度を測定する際に10mM Tri-HCl (pH7.0)で希釈しておりますでしょうか？ もしまだであれば、Trisで希釈して計りなおして見てください。この際のブランクは希釈したTris+RNA溶液分の純水でとってください。 すでにTrisで希釈していたとの解釈で以下に原因を連ねてみます。 まずぐぐったら、http://namaketarou.kakurezato.com/biotechnology/od/index.html に RNAサンプルを測定した場合には、吸光度比A260/A230が>2.0になり、この値より低い場合は、RNA精製に一般的に使用される230〜260に吸収のあるグアニジンチオシアネートの混入が示唆されます。 と書いてありました。 エタ沈の際、上清をしっかりとらないと塩類の残留が起きる場合があります。 またエタノールの残留は、RTに悪影響を与えると記憶しております。 これ以外の原因はTrizolで上清をとる際、下層をひっかけてきた可能性があります。この場合上記のグアニジンチオシアネートの他に蛋白のコンタミもあるかもしれません。 現在のRNA量が多く、失敗したかもしれない心当たりがたくさんあるようなら、再精製をお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.677-3 - 2011/07/15 (金) 11:35:37 - TS グアニジンイソチオシアネートの持ち越しではないでしょうか。 カラムタイプの抽出キットでも、洗浄が甘いと230付近が高くなります。 メーカーに聞いたところ、RT, PCRには問題は起きないと言われ、実際に私のところでもそのようサンプルであっても問題なく解析できています。

(無題) 削除/引用 No.677-2 - 2011/07/15 (金) 10:45:07 - kodamataro 逆転写する前に大切なことは損傷のないRNAであることです。 サンプル量に余裕があればRNAを電気泳動して、リボソームRNAを指標にRNAの品質を確認することをおすすめします。

RNA エタノールコンタミ qPCRへの影響 削除/引用 No.677-1 - 2011/07/15 (金) 10:39:51 - 見習い RNA抽出／cDNA合成／qPCRを見習い中です。 RNAをTrizolで抽出後、260/280=1.71〜1.8、260/230=0.2〜0.55となりました。 260/230が非常に低いことを気にしています。 吸収スペクトルの形状から、洗浄に用いたエタノールの混入が疑わしいと考えています。 このようなRNAサンプルを用いてcDNA合成、qPCRを行う際に問題となる事はありますでしょうか ？ また、このような260/230が著しく低いサンプルが得られる要因について、他にどのような可能性が考えられますでしょうか？ 宜しく御願い致します。

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