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(無題) 削除/引用 No.672-6 - 2011/07/15 (金) 01:09:42 - BBB それはたぶん蛋白質量が多すぎるんだとおもいます。どのくらいのサイズのゲルで,レーンあたりどのくらいの量アプライされてますか。リプローブやTBSに長期間漬けてるうちに、膜上に大量にブロットされた蛋白質（膜に直接ちゃんとくっつかないのとか、あふれて蛋白質のうえに山盛りになったやつとか）の一部ががあるていどとれて減り、それで非特異シグナルが減ったんじゃないかとおもいますがどうでしょうか。ブロッキングは膜の上の蛋白質がない部分をブロックするわけですから、ブロッキングの強化は膜全体にわたる高バックグラウンドの抑制には有効ですが、非特異バンドの対策になるかどうかちょっと疑問です。

(無題) 削除/引用 No.672-5 - 2011/07/14 (木) 10:44:09 - まっくろん 　私も 　・BSA濃度を上げる 　・アプライするタンパク質量を減らす 　を試すのが良いと思います。 　 　同じサンプル（アプライ量を2種類くらい）を泳動＋ブロット（サンプルに余裕があればですが）し、ブロットしたメンブレンを切れば、上記の２項目くらいは一回（細かい条件を評価しないのであれば）で検討できる思います。

(無題) 削除/引用 No.672-4 - 2011/07/14 (木) 00:44:09 - TS わたしもBlocking条件を強くしてみることをまずは提案します。 スキムミルク５％、室温、1時間くらいがもっとも一般的かと思いますが、 現状と異なる条件を試してみてはいかがでしょう。 また、１、２次抗体の溶液にも、1/3-1/2程度のブロッキング溶液を混ぜるのも効果的かと思います。

(無題) 削除/引用 No.672-3 - 2011/07/14 (木) 00:39:09 - おお >ブロッキング：BSA　0.5%（TBS 0.1% tween）　60min RT BSA3%位まで上げられますよね。0.5%って一般的なプロトコールより少ないです。スキムミルク5% (人によっては10%位まで上げる)など違うブロッキング剤何かも使ってみるといいかもしれません。 今回全体のバックグランド出なくタンパクへの非特異の結合なのでちょっとこれで解決するか分かりませんけど。 またTWEENの濃度を若干上げてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.672-2 - 2011/07/14 (木) 00:02:13 - 月詠 一次抗体が異なる場合でも同じような非特異的反応が検出されるのだとすれば、そもそも二次抗体が直接、非特異的にアプライしたタンパク質に結合している可能性がありますよね。 アプライしているタンパク試料と二次抗体の相性がよくないのかもしれません。また、20 μg/laneというアプライ量が多すぎるような気もします。 ですので、対処法としては、まず、「一次抗体なし（＝二次抗体のみ反応）」の陰性対照でも同様な非特異的反応が再現されるか確かめた上で、 （１）二次抗体の希釈倍率をさらに上げる（二次抗体濃度をうすめる） （２）アプライするタンパク試料を減らす あたりから反応条件を再検討してみてはいかがでしょうか。 あるいは一次抗体にビオチン化抗体を用いて、検出はHRP-conjugated streptoavidinを用いれば、二次抗体による非特異的反応は考慮しなくてよくなると思います。

ウェスタンの非特異 削除/引用 No.672-1 - 2011/07/13 (水) 22:38:32 - ノンスペ よろしくお願いします。 タイトルの通りウェスタンの非特異バンドで悩んでおります。 条件は簡単に以下の通りです。 タンパク質のアプライ量：20ug/Lane ブロット：タンク式転写（Tris-grisine　SDS：0%、Met-OH：20%、100V　CV　60min） ブロッキング：BSA　0.5%（TBS 0.1% tween）　60min RT 洗浄：TBS-T　0.1%　tween　10minｘ3回 一次抗体：1/10,000 in TBS-T block bufferを10％含む 二次抗体：1/30,000 in TBS-T block bufferを10％含む　60min　RT 一次抗体は60minRT、4℃o/nどちらでも非特異がでます。 非特異の特徴ですが、バックが高いわけではなく、いくつもの非特異バンドが出ます（10本くらい）。 そして、このとき目的のバンドが検出できません（b-actinですら）。 目的のバンドがで検出できるときは非特異も出ません。 別々の一次抗体を同時にブロットしたメンブレンに反応させても全く同じバンドのパターンで非特異が出ます。 （全体的なバンドの濃さは少し異なりますが、位置、相対的な濃さは同じ） タンパク質量に依存的にバンドが出ているみたいに見えます。 （cbbで濃いバンドが出る位置に一致して非特異が出ているように見えます） 使用している一次抗体はモノクローナルです。 私は最初二次抗体が原因かなと思ったのですが、 同時にソースが異なる一次抗体を使用した場合でも同様の結果が出たこともあるので違うかな… それから、リプローブしたときや、TBS-T中保存して暫くたった（2から3日）メンブレンでは、このようなことが少ないようです。 ブロットしてすぐのメンブレンで多いかもしれないです。 同じプロトコールのはずですが結果が一定せず困っています。 このような現象に対する対処法がわかる方がいらっしゃいましたらどうかご教示の程よろしくお願いします。

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