全26件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.672-27 - 2011/07/22 (金) 03:32:59 - 310 Q様 おっしゃることごもっともです。以降注意いたします。 あべちゃん様 反省はしていますが、このフォーラムでの発言を止めるつもりはありませんのでご心配なく。

(無題) 削除/引用 No.672-26 - 2011/07/22 (金) 00:21:09 - 笑い男 > アプライ量は5ug/Lane　ブロックはBSAを5%にして抗体の希釈もこれで行いました。 2ndAbは10万倍まで希釈しました。 > これらを同時に試したところ、完全になくならないものの非特異バンドは減りました。 > しかし、発現量が低いと思われる目的の蛋白はどうしても非特異に負けます。 > （非特異が強く出る一方で本命の方はほとんど見えていない状態です） > 発現量の多い蛋白はクリアにバンドがでるのですが・・・。 　最初に可能性として書かれていたように、やっぱり二次抗体が原因じゃないかな〜。 　ブロッキングを強くし＆二次抗体を希釈したら・・・結果として非特異は減った。 　アプライ量を減らしたから、全てのバンド（特異的と予想しているバンドも含めて）が薄くなったのも、二次抗体が原因説を否定できないので。 　二次抗体だけを処理した時の結果報告が聞きたいです。

(無題) 削除/引用 No.672-25 - 2011/07/21 (木) 12:54:07 - Q ここに意見を求める人がどの程度の人かというのもありますが、 この掲示板に挙げた実験例を使うか使わないかを読み手にゆだねる前に 自分はどう思ってやってどの程度の実験かをちゃんとことわることは重要だと思います。 使えるか使えないか、きちんと判断できない人が悪いということはちょっと不親切だと思います。 310さんを名指しで悪いですが、最初の書き込みから受ける実験の印象と うさんに突っ込まれた後に出てきたコメントや情報から受ける実験の印象は 明らかに読み手が使うか使わないかを判断するのに違いがありすぎるのではないかと思います。 それを含めて読み手にゆだねるというなら、こんなところでのコメントは判断しようがないということになってしまうのではないでしょうか？生データが無いのであればなおさらです。 言葉じりはネチケットで重要ですけど、自分がどう判断してやったことかということを伝えた上で、こういうレベルの実験ですがどうでしょうという情報を伝えるのは実験者として重要なのではないでしょうか？ 私には、作為という言葉が使われたというより、なんだそんな程度の実験としていたのかということがわかった方が衝撃で、そっちの方がガミガミ言われることだと思いました。

(無題) 削除/引用 No.672-24 - 2011/07/21 (木) 12:31:19 - う 310様 細かくありがとうございます。 私はコンセンサスや結論を導きだしたい気はさらさらなく、ましてどちらが正しいなどは。 ただ、あることをやるに至ったた考えの道筋を知りたいのみです。 それを聞いてやるかやらないか、信じるか信じないかはそれぞれの判断だと。 ただ、最近のジャーナルでは（いいところだけか？）サプリあたりで、 実際の論文のウエスタンの切り抜いたデータは、こんな全体像のウエスタンの結果の この部分を切り抜いた というのがわかるように、ウエスタンの結果に切り抜いた部分が四角で囲ってある図が載っています。求められます。 ここから私が何を感じる書くとまた誤解を生むかもしれませんのでやめますが、 何となくみんな考えることが同じなのかと思ってしまいます。

(無題) 削除/引用 No.672-23 - 2011/07/21 (木) 01:41:36 - あべちゃん >[Re:21] Sriさんは書きました : > あべちゃんさん > 消すからって、そんなこと書く必要あります？ Sriさん、 私もメッセージを投稿するかどうか少し躊躇しました。反感を買ってしまうであろう事もわかっていました。 では、なぜ流せばいいことをわざわざ投稿する必要性を感じたかというと、「作為」という言葉に対する310さんの反応はもっともであるにもかかわらず、私の投稿時には、うさんとSriさんのコメントしかなく、ひょっとしたら310さんが今後コメントするのを控えてしまうのではと思ったからです。310さんを含め色々な人の経験や知識が気軽に投稿できる環境であることを望むからです。 うさん、 「作為という言葉には他人に対する悪意ぶつけたものではありません。 結果を客観的に見つめているときにつぶやく内なる声でありました。」 うさんのコメントに悪意はなかったのだなぁと理解しました。うさんに向けた投稿内容は撤回します。ごめんなさい。私のコメントがうさんの「気軽に投稿できる環境」を壊している矛盾に反省します。 それでも「作為」という言葉は「内なる声」にとどめた方がよいし、投稿したら「内なる声」じゃぁなくなると思います。 トピ主さん、 あなたのトピックを荒らしてしまい、申し訳ないです。 「後で消すからと、あおる様な書き込み」 この辺りのネットエチケットがよくわからないので、とりあえず削除するのはやめておきます。

(無題) 削除/引用 No.672-22 - 2011/07/20 (水) 22:03:05 - 310 う様 人それぞれ、基準はあって良いと思いますし、コンセンサスを無理につくる必要は、ありません。このフォーラムで書き込まれる事は各自の良心に、ゆだねられますし、それを信じる信じないは読み手の自由です。そもそも生データ無しに、議論して結論を出すのは、無茶なので禁じられていると私は思っています。 私がこの実験を行う前に、私の隣のドクターは、エクストラバンド一杯のウエスタンのX-線フィルムから必要な場所をじょきじょきはさみで切り抜いて投稿用に使っていました。他のバンドのデータがいらないと言う理由です。私には抵抗あるのでやりませんでしたが、それも一つの方法かなと思っています。私のバンドを消すための吸着も見る人によっては、同様かそれより激しい行為に見えるという事でしょう。言い訳としては、免疫沈降でとった蛋白の解析をして、特異性の証明をする予定だったということですが、今となってはこれも、とらぬ狸の皮になってしまいました。 結局、個々の実験の信頼性にこだわらず突き進んだその方の論文はJCIに掲載されました。一つづつの実験精度にこだわるよりは、その時間を他の実験にまわして、包括的に処理した彼の手腕は優れたものだと思います。なかなかまねできるものではありませんが。 実験初診者様 ＞「ちょっとこの方法では使えるようになったとは言えないかも」 というより、あくまで実験の中での一例を示し、そこから何か参考になればと思った次第です。使う使わないは読み手の自由にまかせるつもりでしたが、結果的に混乱を招いたことはお詫びします。実験結果は出た時点では特殊例に過ぎず、論文にするまでに一般化していくものだと思っています。データを開示できる範囲で学会に発表し、議論するのはそのためもあると思っています。

(無題) 削除/引用 No.672-20 - 2011/07/20 (水) 17:31:52 - 実験初診者 310さん 情報ありがとうございました。 後で消すからと、あおる様な書き込み等もありましたが、結果として ＞以上です。ウエスタンの結果は、改善しました。しかし、これらの結果使えるようになった抗体はラボを移るときに誤って捨てられてしまいました（TT)。なので、この方法は保存がどのくらいできるか、硫安沈殿して濃縮しないともたないか、などは分かりません。 この情報よりも、310さんが「ちょっとこの方法では使えるようになったとは言えないかも」ということがわかり良かったと思いました。参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.672-19 - 2011/07/20 (水) 17:17:52 - う 310様 私は実験をするときに常に 「こういう結果が出たけれど、これは自分の作為ではないか？」 と、ある意味で怯えながら結果を見つめております。 そのため、作為という言葉には他人に対する悪意ぶつけたものではありません。 結果を客観的に見つめているときにつぶやく内なる声でありました。 これから書くのは、以前に、同じように非特異と思われるバンドがあり、 そのときに自問自答したことです。 ウエスタンでバンドが数本出た、目的の分子量と同じものもある。 それ以外のバンド付きのフィルターで除いたら良いんじゃないのか？ 逆ウエスタン的な独創的な（独りよがり）発想でイケてるかも。 でも、それは目的のタンパク質の分子量と同じだという理由で そうこじつけること作業と同じじゃないか？ だってすべてが非特異という可能性もあるじゃないか。 私はネガティブなので、こういうことを悶々と考えるのです。 とりあえず解決策として 別の細胞で全長cDANを過剰発現してウエスタンしてみようかなぁ それか、そのライセートで吸収した抗体ではどうなるかやってみようかなぁ 結局、一体何が目的の実験なのかわからなくなり、 結論としては、その抗体に関しては何も解決することがなかったということで。 抗体は良いものを作る、そして良いものを使うに限るという、 打算的な結論に至った次第です。 他の人はどうなのかと思った次第。 長文失礼。

(無題) 削除/引用 No.672-18 - 2011/07/20 (水) 16:31:16 - う あべちゃん様 ＞日本語が使えないかわいそうな人 あるいは 人を馬鹿にする癖のある嫌な人 その通りです。 申し訳ありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.672-17 - 2011/07/20 (水) 15:18:23 - あべちゃん 作為・・・事実であるかのように故意に手を加えること。つくりごと。 という意味がある以上は、ひとさまの実験結果・データに対して「作為」という言葉を「悪意ありません」などと言って用いる人は 日本語が使えないかわいそうな人 あるいは 人を馬鹿にする癖のある嫌な人 だと感じてしまいます。 310さんが勝手に怒ったかのような掲示板の流れにはだまってられません。 でも、この内容も掲示板の趣旨に外れるので、しばらくしたら削除します。

(無題) 削除/引用 No.672-16 - 2011/07/20 (水) 14:09:49 - 310 う様、Sir様 ＞そんなに苛々した書き方もやめたほうがいいですよ。 不愉快にさせてしまい申し訳ありませんでした。 ＞結果は自分の作為ではないのか？ 私にとっては、”作為”はよほど敵意の感情があっても、なかなか言えない単語なので、これは相当馬鹿にされてるのかなと思ったわけです。 もとより私には敵意も争う気もありません。 ＞実験初診者様 最初に書いたと思いますが、この抗体は吸着実験の後、新しい職場に送ってもらうはずが、全部廃棄されてしまいました。血清もほどんど送られる事無く、捨てられたようです。別の場所に保管していたDNA系の試薬類は送られてきたので、私の保管場所が良くなかったのでしょう。新しい職場では別のプロジェクトがあり、この抗体を使う実験は後回しになっています。この話をしたところボスは”今度はモノクロでやろう”と言ってくれましたが、他所のラボの手伝いやグラントに出す実験など、いろいろあってまだ手出し出来ません。 論文に書くとしたら、そのままでは駄目でしょう。 抗原のペプチドをいくつかに分割してカラム吸着によるポリクロ抗体の精製を行って、目的の蛋白と反応しやすい抗体をとってこようと思っていました。その上でIPでとってきた蛋白を質量分析して、アミノ酸を解析しようと思っていました。 ポジコンはHelaでした。短冊のようにしたフィルタを使い、ペプチドカラム精製した抗体で、抗体濃度やブロッキングなど実験条件を検討して、ほぼシングルバンドの結果が出たので、ターゲットのひとつのMelanomaで試したところ、報告されている当該蛋白の分子量と異なる場所に、多くのバンドが見られました。免疫染色に使いたいと思っていたのですが、これでは無理で困っていました。メラノーマでターゲットの蛋白発現を完全に抑える事ができ、目的以外の蛋白で抗体をブロッキングできればいいなとも思っていましたが、抑える方法が見つかりませんでした。ちょうどこのフォーラムで免疫染色かウエスタンで再利用した抗体で、良い結果が出ている話を読んで、引越しのときに廃棄しようとしていたウエスタンのフィルタで吸着させてみようと、実験を行った次第です。

(無題) 削除/引用 No.672-15 - 2011/07/20 (水) 11:09:04 - 実験初診者 スレに関係無いとか言われるかもしれませんが、 議論したくなる刺激に対して抗えなくて質問させて下さい。 310さん その実験結果を論文に採用されているのであれば教えていただきたいのですが、 そのようにした実験方法は論文にどう書かれたのでしょうか？ 変な質問申し訳ありません。 私もそういう実験考えたけれど、マテメソにそう書いたらどういう反応が帰ってくるのかなぁと でも、何も書かないのは問題だよなぁと二の足を踏んだことがあるもので・・・。 お気にさわったらすみません；

(無題) 削除/引用 No.672-14 - 2011/07/20 (水) 10:55:19 - Sri 310さん そんなに苛々した書き方もやめたほうがいいですよ。

(無題) 削除/引用 No.672-13 - 2011/07/20 (水) 10:45:01 - う 310様 詳細な説明ありがとうございました。 しかし、どこかしら怒りを帯びているように感じられ、 私の文章が悪かったのかと反省致しておるところです。 別に、批判をして「そんな実験だめた」という揚げ足取りではなく、 そのような実験を考えたことがある人が多分にいると私は思っており、 しかし、どうしてあまり実行しないかというと、 私が挙げた疑問を持った結果、ある種「めんどくさい」に似た結論に至ったためではないかと 推察するところです。 なので、310様もそういう過程を踏んだ結果、実行しただろうと思い、 どのような考えと妥協をもたれたのか、と思った次第。 再度、喧嘩をふっかけるつもりは全くなかったと申し上げておきます。 上記のようなディスカッションがしたかっただけで。

(無題) 削除/引用 No.672-12 - 2011/07/20 (水) 05:32:30 - 310 う様、出来るだけ説明いたしますが、ご不満が残られても私には、これ以上どうしようも無い事をご了承ください。 まず、最初に私がこの方法を試したのは、周囲の先生方とも話し、文献も調べ可能性が高いと思われることをやったのち、苦し紛れに行ったということをご理解ください。一般的な方法とも思っていませんが、使えない抗体をそのまま放置するよりはましだと思って行いました。 >ここで、抗体は目的のタンパク質を認識しているということをおっしゃって >いると思いますが、 >それでは何故「複数のエキストラバンドが出てくるのか」という疑問と 目的の蛋白”も”認識していると思っています。対象蛋白に含まれるペプチド抗原を認識するからといって、目的外の蛋白は認識しないとは限らないと思います。 >単に「切り抜いたところにあるタンパク質（分子量が同じだけのタンパク質 >群かも）を認識する抗体」が濃縮されるだけで、 >「目的のタンパク質を認識する抗体」を濃縮するとは意味が違うのではない >かという疑問。 ここで使っている抗体は、あらかじめペプチドカラムを使い単離しています。なので、残りの手段は対象蛋白の分子量による分離でした。ほかに抗体の特異性をどうあげるか、そのときは思いつきませんでしたし、周りの方のご意見も伺いましたが、どうしてもうまくいかず、ここのスレッドのどれかでウエスタンを繰り返し行った抗体の方が特異性が高くなると言う話を読んで、だめもとで行いました。あくまで、ひとつの参考意見として述べたまでです。 結果の解釈としては、ポリクローナル抗体の場合、ペプチド抗原(17a.a.)でもエピトープは複数あり、それぞれに対応する抗体ができていると考えていました。これらは、どちらもペプチドブロッキングがかかると思いますが、別のエピトープを認識するのであれば認識する蛋白が異なる可能性があります。 私は、ここから抗原のペプチドを複数に断片化して各エピトープごとの抗体を分離したいと思っていましたが、時間切れで出来ませんでした。蛋白の証明はIPで分離した蛋白を、質量分析器にかけたら良いと、同じラボの先生に言われていたのでそうするつもりでしたが、たどりつけませんでした。 ＞何をやっているのかわからないのではないか？ ＞結果は自分の作為ではないのか？ 一応、前述のような理由がありましたが、うさんが納得いかず、何をやっているか分からない私の作為による結果であると思い続けても、私としてはもうこれ以上のご説明はしかねます。 >スレの内容と異なる書き込みと思いますが、 全くです。 ＞この辺をどう思うのか聞いてみたい。 答えてほしいならそう書くべきでしょう。あなたが聞いてみたいというだけで、私は答えなければいけないのでしょうか？頼み方があると思います。

(無題) 削除/引用 No.672-11 - 2011/07/19 (火) 16:01:45 - う スレの内容と異なる書き込みと思いますが、 310さんの方法だと、 ＞ペプチドブロッキングするとエクストラバンドが全部消える抗体を使った際 ここで、抗体は目的のタンパク質を認識しているということをおっしゃっていると思いますが、 それでは何故「複数のエキストラバンドが出てくるのか」という疑問と 目的の「分子量（あくまで分子量）」の部分を抜いたフィルターでやった行為は 単に「切り抜いたところにあるタンパク質（分子量が同じだけのタンパク質群かも）を認識する抗体」が濃縮されるだけで、 「目的のタンパク質を認識する抗体」を濃縮するとは意味が違うのではないかという疑問。 以上の少なくとも２つの疑問で 何をやっているのかわからないのではないか？ 結果は自分の作為ではないのか？ と私は思うのですが。 この辺をどう思うのか聞いてみたい。

(無題) 削除/引用 No.672-10 - 2011/07/19 (火) 05:05:11 - 310 ペプチド精製しても、抗体濃度、ブロッキング条件を検討しても駄目で、ペプチドブロッキングするとエクストラバンドが全部消える抗体を使った際、以下の方法で若干の改善をみました。 余っているウエスタンのフィルターを集め、目的分子量の部位のフィルタを切除し、次いでついてる抗体をはがす。ブロッキング剤と抗体を混合した液体を多め（抗体濃度も高め）に作り、この中に先ほどのフィルターを入れる。半日ー1日ごと、フィルタを出して再生し溶液中に戻す。これを数日繰り返す。フィルターを全部取り出して、溶液中の抗体濃度を通常使う濃度に戻して、目的サンプルを含むフィルターと反応させる。 以上です。ウエスタンの結果は、改善しました。しかし、これらの結果使えるようになった抗体はラボを移るときに誤って捨てられてしまいました（TT)。なので、この方法は保存がどのくらいできるか、硫安沈殿して濃縮しないともたないか、などは分かりません。

(無題) 削除/引用 No.672-9 - 2011/07/15 (金) 15:52:34 - ats 腹水から調製したmAbだと、混入する他のIgGが非特異バンドの原因かもしれません。 思いつきですが、mAb溶液に当該抽出液を混ぜ、非特異バンドの原因IgGを吸収させてしまうのはいかがでしょうか。 目的IgG(mAb)は相対的に多いので全量は吸収されずに残るので、混合液を用いてウェスタンブロットを行えば目的バンドは検出できるかもしれません。 もっとも、変成タンパクでないと吸収できない可能性もあります。

ご回答ありがとうございます。 削除/引用 No.672-8 - 2011/07/15 (金) 11:17:07 - ノンスペ 皆様、ご回答ありがとうございます。 ご指摘のアプライ量を減らす、ブロックを厳しめにする　を検討してみました。 アプライ量は5ug/Lane　ブロックはBSAを5%にして抗体の希釈もこれで行いました。 2ndAbは10万倍まで希釈しました。 これらを同時に試したところ、完全になくならないものの非特異バンドは減りました。 しかし、発現量が低いと思われる目的の蛋白はどうしても非特異に負けます。 （非特異が強く出る一方で本命の方はほとんど見えていない状態です） 発現量の多い蛋白はクリアにバンドがでるのですが・・・。 目的のタンパク質の分画精製と別メーカーの抗体を検討すべきかなと思いました。 ご回答いただきました　月詠様、おお様、TS様、まっくろん様、BBB様、ka様ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.672-7 - 2011/07/15 (金) 10:30:35 - ka 可能ならば、目的の蛋白質の細胞画分を荒くでも精製して、とってくれば 非特異的な吸着は減ります。 抗体濃度をさらに十倍希釈して、4℃　O/Nも非特異的吸着を減らします。 あとは他の方の通り、ブロッキング剤の検討、ロード量の検討。 大丈夫だと思いますが、一次抗体を一度遠心して、アグリゲーション していないかを確認するのも必要かもしれません。

全26件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---