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(無題) 削除/引用 No.668-10 - 2011/07/16 (土) 11:45:01 - fire みなさま 返信ありがとうございました。 今まで使っていた酵素（クローニング前に使っていた酵素）ではなくて、 KOD系の酵素に変えたら、きれいに増えてきました。 前使っていた酵素だと、この配列の入ったコロニーに対して、 増えにくいとういうことがわかりました。 こういうこともあるもなんですね。

(無題) 削除/引用 No.668-9 - 2011/07/15 (金) 05:30:01 - 310 >ここまでしないとコロニーPCRがうまく行かないのであれば、なんか根本的 >に問題があるような気がします。 根本的とはなんでしょう。具体的におっしゃってくださればありがたく存じます。 たしかに大抵は、TK-1様のいうとおり普通にPCR溶液で爪楊枝なりチップなり入れればうまくいきます。私も、実験環境に応じてそうやることもあります。 たまにコロニーPCRがうまく出来ない際、何で出来ないのかは無視して、ミニプレップやればいい、と判で押したように言われるのが、納得いかずDNase不活化の文献（BioTechniques 29:38-42 (July 2000））をもとに作り上げたのが前述のプロトコールです。 インサートの有無をチェックするだけでは、ミニプレップを使う必要がなくなりました。ただ今でも少数コロニーをとる場合などでは、コロニーPCRはやらずミニプレップだけすることもあります。逆にシーケンスチェックのみの場合、ミニプレップを行わない場合もあります。私にとっては、このコロニーPCR法により選択肢が広がって実験しやすくなったので、ご紹介したしだいです。 そこまでの精度が必要ないとか、無駄だと思われて、この方法を使わなくても、仕方が無いとは思っています。実際この方法はもう少しステップを減らすことは可能で、Tris/DTT/TritonX-100内での加熱処理以外は、重要ではありません。例えばバクテリアを撒く前にLBで洗うのは、寒天培地の何も無いところをこすって陽性反応が出てしまったためですが、混合するプラスミドの量によっては不要でしょう。 しかし具体例も無しに”根本的に問題がある”と言われ、何をどうすれば良いのかと非常に不安になりました。しかしこれは私情にすぎません。相手の感情にかまわず意見を言う事は大切ですし、私に否定する証拠があるとも思えません。事実はTK-1様の言われるとおりかもしれません。ご相談された方は、出てきた意見を総合的に判断して、ご自由に方針を決定していただければいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.668-7 - 2011/07/14 (木) 07:42:19 - TK-1 >[Re:6] 310さんは書きました : > まず大腸菌をプレートにまく前に事前培養37C1hrして、1000g5分で大腸菌を落とし上清を捨て、培地を加えもう一度遠心と上清廃棄をしたのち、適当な量の培地を加えて懸濁してプレートに撒きます。これらの操作は、トランスフォーメンション溶液内の菌体に入らなかった鋳型のキャリーオーバーを防ぐために行っています。コロニーが生えたら、後のミニプレップ用に寒天培地に植え継いでいますが、液体培地に植え継ぎつつ下記のコロニー溶液を作成し、コロニーPCRの結果が出たらすぐプラスミドの精製を始めることもあります。 > > 次に10x Colony Bufferとして以下の溶液を作成。-20Cで長期間保存可。（加熱処理との組み合わせで、DNaseの不活化および鋳型の変性を行います。） > 100mM Tris(pH9) > 100mM DTT > 10% TritonX-100 > > これを10倍希釈し、コロニーを少し入れます。95Cで20分加熱した後、氷温で冷やします。好みにより遠心して上清を使います。コロニー溶液をPCR溶液の数％程度になるように加えてPCRを30サイクル行います。この際プライマーはM13などがあるMulti Cloning Siteの外側の配列から、大腸菌にかぶらない配列を選んで作ります。TmはprimerBlastで60度を目安にしています。 > > 以上はまだ2種類のベクターでしか試していない方法ですが、一般のコロニーPCRより確実性が高いです。このPCR産物を精製し直接DNAシークエンスすることもあります。大体問題はありませんが、時々配列がヘテロに見える場合があり、この際はベタインなどの変性剤を加えるか、ミニプレップしたプラスミドから配列を読むとうまく出来ます。 > > これらの私の環境ではうまく働きますが、各々の状況に応じ改変が必要に思います。ご参考までに。 いろいろ試されて、このような丁寧な方法にたどり着いたのかもしれませんし、こんな言い方は失礼ですが、 ここまでしないとコロニーPCRがうまく行かないのであれば、なんか根本的に問題があるような気がします。 targeting vectorを作ったりするときに5kb前後やそれより長いfragmentをBACの入ったコロニーから増やすことはありますが、LB plateに生えたコロニーをtipで触って、保存用のプレート、liquid LBにさっとつけてからPCR溶液にそのまま入れてやっていますが、そんなに苦労することはないです。 トピ主さんへ、 クローニングの場合はどうせミニプレップをするので、４つ５つ以上のクローニングを平行してやっていてミニプレップの数をそれなりの数まで減らす必要がないのであれば、適当な数を拾ってミニプレップをすればいいことです。よほど効率の悪いクローニング（プラスミドが不安定な場合など）でもないのに、普通にミニプレップをしてあたりが取れないのであればそれは手技上の問題でそっちを解決する方が先かと思います。

(無題) 削除/引用 No.668-6 - 2011/07/14 (木) 04:00:03 - 310 まず大腸菌をプレートにまく前に事前培養37C1hrして、1000g5分で大腸菌を落とし上清を捨て、培地を加えもう一度遠心と上清廃棄をしたのち、適当な量の培地を加えて懸濁してプレートに撒きます。これらの操作は、トランスフォーメンション溶液内の菌体に入らなかった鋳型のキャリーオーバーを防ぐために行っています。コロニーが生えたら、後のミニプレップ用に寒天培地に植え継いでいますが、液体培地に植え継ぎつつ下記のコロニー溶液を作成し、コロニーPCRの結果が出たらすぐプラスミドの精製を始めることもあります。 次に10x Colony Bufferとして以下の溶液を作成。-20Cで長期間保存可。（加熱処理との組み合わせで、DNaseの不活化および鋳型の変性を行います。） 100mM Tris(pH9) 100mM DTT 10% TritonX-100 これを10倍希釈し、コロニーを少し入れます。95Cで20分加熱した後、氷温で冷やします。好みにより遠心して上清を使います。コロニー溶液をPCR溶液の数％程度になるように加えてPCRを30サイクル行います。この際プライマーはM13などがあるMulti Cloning Siteの外側の配列から、大腸菌にかぶらない配列を選んで作ります。TmはprimerBlastで60度を目安にしています。 以上はまだ2種類のベクターでしか試していない方法ですが、一般のコロニーPCRより確実性が高いです。このPCR産物を精製し直接DNAシークエンスすることもあります。大体問題はありませんが、時々配列がヘテロに見える場合があり、この際はベタインなどの変性剤を加えるか、ミニプレップしたプラスミドから配列を読むとうまく出来ます。 これらの私の環境ではうまく働きますが、各々の状況に応じ改変が必要に思います。ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.668-5 - 2011/07/13 (水) 15:30:49 - おお プライマーが違えば条件も変わってくるでしょう、その結果増やすのが難しくなってるかもしれません。外の(ベクター上の)プライマーで増やす限り同一のテンプレート(余分な配列がついている)でもないですし。

(無題) 削除/引用 No.668-4 - 2011/07/13 (水) 13:55:28 - ~ >コロニーだと増えにくいとかもあるのでしょうか？ 元のテンプレートの条件であれば増える場合が多いと思いますが、 コロニーPCR用に甘い条件（温度やpolymerase、バッファー）にしていませんか？

(無題) 削除/引用 No.668-3 - 2011/07/13 (水) 12:48:20 - fire おお様 ご返事ありがとうございます。 5'側は極端なGC richな配列でした。 こういう場合、cDNAが鋳型の場合は増えるのに、コロニーだと増えにくいとかもあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.668-2 - 2011/07/13 (水) 12:37:35 - おお >ある特定の配列の場合、コロニーPCRで増えない場合があるのでしょうか？ あります。内部にGCリッチな部分があるとか、そうでなくても伸長反応などに不利な配列があればPCRが難しくなってきます。からがPCRでひっかかって、PCRがかからないコロニーが比較的多くあるならそのコロニーはポジである可能性があるので、プラスミドを取るのが目的ならばミニプレップしてみるといいと思います。

コロニーPCR増えない 削除/引用 No.668-1 - 2011/07/13 (水) 12:01:56 - fire PCR産物をTAクローニング後、 コンピテントセルに形質転換して、 得られたコロニーをM13プライマーを用いてコロニーPCRを行いました。 1.5kbほどの遺伝子のインサート（シングルバンドをTAクローニングした）のコロニーPCRは 全くバンドが見られませんでした。 別の遺伝子でPCRした2kbや3kbのインサートではコロニーPCRのバンドは見られましたし、 空のものでもM13によるPCRバンドは確認できました。 なので、コロニーPCRの系自体はうまくいっています。 ある特定の配列の場合、コロニーPCRで増えない場合があるのでしょうか？ それとも何か他の原因が考えられるのでしょうか？

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