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ゲノムDNAのdenatureについて トピック削除
No.639-TOPIC - 2011/07/07 (木) 19:02:53 - Gen
こんにちは。質問に答えて頂ければ幸いです。

キアゲンのQIAamp DNA Mini Kiで動物細胞からゲノムDNAを抽出しました。このDNAをTAEバッファーで1%アガロースゲル電気泳動をしたところ、10000bpほどのバンドが検出できました。
ここまでは予定通りだったのですが、このDNAを95℃,10min denatureして4℃に急冷したものを電気泳動すると、バンドが見えなくなってしまいました。

この原因として
１．DNaseがコンタミしていて加熱中にDNAが分解した
２．denetureによってゲノムDNAが１本鎖になったため、様々な高次構造をとりバンドとして認識できなくなった
の2つを考えているのですが、どちらの可能性の方がありえそうでしょうか?

ちなみに、１の可能性を検証するのであればDNAseの活性が高い37℃でインキュベートすればよいかと考えています。

宜しくお願いします。
　
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No.639-8 - 2011/07/08 (金) 21:02:32 - Harmonia
マウスだと、20 kbのマーカーと並ぶくらいに出ておかしくない。
大腸菌でも、20 kb のマーカーと並ぶくらいに出る。
10 kb というのは小さすぎないか？

(無題) 削除/引用
No.639-7 - 2011/07/08 (金) 09:29:38 - ~
>動物細胞からゲノムDNAを抽出
流したのは制限酵素等できっていないゲノムDNAなのですよね。
ゲルが古かったりすると、ゲルに入らずにウェルに残ったりします。
変性して立体構造が変わり、ゲルに入りにくくなるというのはありえないことでは無いと思いますが。

(無題) 削除/引用
No.639-6 - 2011/07/07 (木) 23:36:33 - Gen
皆さんありがとうございます。

確かに1も2も考えにくいですよね・・・ただ「ゲノムDNAをdenature後に電気泳動する」という経験が無いのでこんなことを考えてしまいました。

泳動量は300ngなので、エチブロが結合しにくくなっても完全にバンドがなくなるというのは不可解な気がします。total RNAでもこれぐらい泳動すれば検出できますし。

複数回やってもこの結果が得られるので、明日市販品のゲノムDNAで同様の操作をしてみます。何かわかったらまたご報告しますので、宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用
No.639-5 - 2011/07/07 (木) 21:46:13 - おお
一本鎖のDNAのえちブロを使った感度は2本鎖より可也低いです。マイクログラムオーダーでのせると感覚的にはそれでも検出できるようなきがします。うすくすめあーになってませんか?すこしカメラの感度(露光時間)を上げてみるとか。。。

(無題) 削除/引用
No.639-4 - 2011/07/07 (木) 20:57:31 - AP
どのくらいのDNAサンプルを乗せたのかの情報がないようですが、

EtBrで検出できる電気泳動のDNAバンドは、一バンド1 ngくらいが限度です。
インタクトのDNAが単一のバンドであってそれが十分みえたとしても、変性してスメアになって広い範囲に拡散したらEtBrの検出限界以下になって見えなくなった、ということはないでしょうか。一本鎖に変性するとEtBrの感度も下がることですし。

(無題) 削除/引用
No.639-3 - 2011/07/07 (木) 20:25:57 - たなぼた
1はありえないでしょう
2も･･･

その実験は何回やってもそうなりますか？
何らかの操作ミスをしてる可能性のほうが高い気がします

(無題) 削除/引用
No.639-2 - 2011/07/07 (木) 19:10:01 - う
DNAはdenetureしても、

分子量は変化するが、DNAは染まって見えます。

バンドが見えなくなるとは、どういうことでしょうか？

ゲノムDNAのdenatureについて 削除/引用
No.639-1 - 2011/07/07 (木) 19:02:53 - Gen
こんにちは。質問に答えて頂ければ幸いです。

キアゲンのQIAamp DNA Mini Kiで動物細胞からゲノムDNAを抽出しました。このDNAをTAEバッファーで1%アガロースゲル電気泳動をしたところ、10000bpほどのバンドが検出できました。
ここまでは予定通りだったのですが、このDNAを95℃,10min denatureして4℃に急冷したものを電気泳動すると、バンドが見えなくなってしまいました。

この原因として
１．DNaseがコンタミしていて加熱中にDNAが分解した
２．denetureによってゲノムDNAが１本鎖になったため、様々な高次構造をとりバンドとして認識できなくなった
の2つを考えているのですが、どちらの可能性の方がありえそうでしょうか?

ちなみに、１の可能性を検証するのであればDNAseの活性が高い37℃でインキュベートすればよいかと考えています。

宜しくお願いします。
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