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ベクター構築の技術　〜Self Ligation〜 トピック削除
No.638-TOPIC - 2011/07/07 (木) 18:33:37 - ムッタ
いつも参考にさせて頂いています。
今回ベクターの構築技術で疑問があり質問させて頂きます。
現在ベクターを構築していて、PCX-EGFPに発現させたいinsertを導入して
PCX-EGFP-insertのvectorを構築しました。

このベクターはEGFP-fusionタンパク質として用いるのですが、ベクターからEGFPの配列をEcoR1で切り出してゲル抽出を行った後に、self LigationさせPCX-insertのベクターを作製したいと考えています。
実際にこの方法で可能でしょうか？？
実際EGFPを切り出したvectorどうしがくっついてしまう可能性も考慮しなければならないとは思うのですが、どれぐらいの確率でうまくself ligationした目的のvectorが得れるでしょうか？？
またうまくself　ligationをさせるにはどのようにすればよいでしょうか？
試した事のある方やわかる方がいればアドバイス頂けると幸いです。

<<補足>>
＊このようにEGFPの配列を除こうと考えています

//-----EcoR1【---EGFP---】EcoR1---【insert】---//　
　　　　　　　　　↓
*EcoR1で制限酵素処理
　　　　　*ゲル抽出　
↓
//------EcoR1　　　　　　EcoR１----【insert】---//
↓
　　　　　　self　Ligation
　　　　　　　　　↓
//-----------EcoR1----【insert】------//

＊EGFPを切り出してもフレームは変わらないです。
　
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(無題) 削除/引用
No.638-5 - 2011/07/08 (金) 11:37:57 - ムッタ
う様、AP様、おお様、ご意見ありがとうございます。問題なくできそうなので一安心いたしました。
DNA濃度を薄めにしてligationするのとベクターを切らず、EGFP遺伝子内部を切る酵素の消化を加えるのは思いつかなかったです。非常に勉強になりました。

(無題) 削除/引用
No.638-4 - 2011/07/07 (木) 21:27:41 - おお
特別な考慮はいらないと思います。ほぼ確実にセルフが取れてきます。

理由はセルフは一分子内にライゲーションパートナーがあるために、分子間のライゲーションより効率がよいです。

どうしても気になるならライゲーションの時のプラスミドの濃度を下げると分子間の接触機会を下げる事ができますが、私は気にしたことがありません。

(無題) 削除/引用
No.638-3 - 2011/07/07 (木) 21:11:13 - AP
できますよ。
ゲル切り出しもしないでそのままやっても、コロニーをいくつか拾えばあたりが見つかるくらいだとおもいます。脱リン酸化なしのEcoRI消化ベクターとEcoRIインサートを当モル混ぜてligationした場合を考えれば、ベクターのセルフライゲーションのほうがインサートが入ったやつよりたくさんのコロニーを生じるでしょう？　同様にサブクローニングの経験からいって、ベクターの二量体（あるいはそれ以上）はめったに取れてこないとです（そういうのは、たぶん複製などの生理活性に問題あり？）。

幾分でも効率を上げるためのtipsとしては、
・ベクターを切らず、EGFP遺伝子内部を切る酵素の消化を加える。EGFPの断片がコンタミしてもベクターに入りにくくなる。
・DNA濃度を薄めにしてligationする。DNA断片同士の衝突より、ひとつのDNA断片の両端同士が衝突する確率があがるので、セルフライゲーションを起こさせたい時にはよくやる方法です（濃度の目安はTAKARAの資料にあったかな）。

(無題) 削除/引用
No.638-2 - 2011/07/07 (木) 19:01:04 - う
普通に、可能です。
できると思います。

ベクター同士のライゲーションをどうするかということについては、

出てきたクローンを何個かとって、non-cutで
元のGFP入りのプラスミドをnon-cutで

それぞれ泳動すれば一目瞭然かと。

目的のベクターは、
少なくとも、元のGFP入りよりも分子量は小さいはずですから。

ベクター構築の技術　〜Self Ligation〜 削除/引用
No.638-1 - 2011/07/07 (木) 18:33:37 - ムッタ
いつも参考にさせて頂いています。
今回ベクターの構築技術で疑問があり質問させて頂きます。
現在ベクターを構築していて、PCX-EGFPに発現させたいinsertを導入して
PCX-EGFP-insertのvectorを構築しました。

このベクターはEGFP-fusionタンパク質として用いるのですが、ベクターからEGFPの配列をEcoR1で切り出してゲル抽出を行った後に、self LigationさせPCX-insertのベクターを作製したいと考えています。
実際にこの方法で可能でしょうか？？
実際EGFPを切り出したvectorどうしがくっついてしまう可能性も考慮しなければならないとは思うのですが、どれぐらいの確率でうまくself ligationした目的のvectorが得れるでしょうか？？
またうまくself　ligationをさせるにはどのようにすればよいでしょうか？
試した事のある方やわかる方がいればアドバイス頂けると幸いです。

<<補足>>
＊このようにEGFPの配列を除こうと考えています

//-----EcoR1【---EGFP---】EcoR1---【insert】---//　
　　　　　　　　　↓
*EcoR1で制限酵素処理
　　　　　*ゲル抽出　
↓
//------EcoR1　　　　　　EcoR１----【insert】---//
↓
　　　　　　self　Ligation
　　　　　　　　　↓
//-----------EcoR1----【insert】------//

＊EGFPを切り出してもフレームは変わらないです。
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