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(無題) 削除/引用 No.633-16 - 2011/07/08 (金) 09:10:57 - ~ >なぜ切出し後にライゲーションする場合はover night処理しないようにしているのですか？ 先輩からそう言われたからです。 理由は、末端が削れたり、スター活性で微妙に違う長さのものが取れてくると困るからだそうです。 >[Re:14] おおさんは書きました : >その状態では得られたDNA溶液に塩が交じっている可能性があります。 これか！！ 移動度が遅いのは塩濃度が低いためと思って、低くなりうる部分を探していました。

投稿者です。 削除/引用 No.633-15 - 2011/07/08 (金) 01:22:58 - kawashima 皆様、ご回答ありがとうございます。 泳導の時には、takaraの10xLoading bufferを1/10倍に希釈して(最終濃度が1xになるように)混ぜて、ペレットを溶かしています。 "様 『私は切り出し後にライゲーションに回す場合は、over night処理はしないようにしています。そのため、チェックのステップを入れています。』 とのことですが、なぜ切出し後にライゲーションする場合はover night処理しないようにしているのですか？ また、おっしゃるように、今後はチェックも入れようと思います。 おお様 エタ沈後には70%エタノールでwashしなければならなかったのですね。知らなかったので、70%エタノールwashはしていませんでした。それがバンドが高く出た原因ではないかとのことなので、次回からは必ず行うようにします。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.633-14 - 2011/07/07 (木) 21:53:22 - おお >[Re:11] kawashimaさんは書きました : > エタ沈に関しては、100%エタノール、NaAc、グリコーゲンをそれぞれ250μl、10μl、1μl（全量100μlに対して)加え、遠心してペレットにして、上清を捨てて、ペレットを水に溶かしています。何か問題ありますでしょうか？ もんだいあります。その状態では得られたDNA溶液に塩が交じっている可能性があります。塩(特に塩化ナトリウム)はアルコールに解けにくいので幾らかは共沈してきている可能性があります。70%のエタノールを加えて混和したあともう一度遠心して上澄みの溶液を除き、風乾後水がTEに溶かしてください。 塩が影響して移動度が遅くなっているのが原因だと思います。

(無題) 削除/引用 No.633-13 - 2011/07/07 (木) 14:58:43 - ~ >ペレットを水に溶かしています。 マーカーと同じくらいの塩濃度のバッファーではなく、水に溶かしているのですか？ 逆に塩濃度が低いすぎということはありませんかね。 メーカーによってはローディングバッファーに塩が入っていないですし、電気が流れにくくなるので移動度が低いのと話が合いますし。

(無題) 削除/引用 No.633-12 - 2011/07/07 (木) 14:52:59 - ~ >制限酵素処理はover nightでしているので、十分だと思うのですが…。 私は切り出し後にライゲーションに回す場合は、over night処理はしないようにしています。そのため、チェックのステップを入れています。 ただ、over nightであってもいきなり本番で全量流して、おかしな状態だったら今のように困りますよね。 チェックを1回挟むことは悪いことでは無いと思いますが。 >一つのウェルに大量に流したことが原因と考えるしかないのでしょうか？ アプライ量だけがパラメーターが結果が変わるのであれば、そのパラメーターが原因と考えるのが自然と思いますが。 （エタ沈でバッファーチェンジしていますのでそこもパラメーターになりますが） 影響を与えているのがDNA自体の量なのか、dye入りのバッファーに含まれる成分の量なのか等は書かれている情報からでは推測のしようがありませんが。 気になるのは、今の泳動ではH bufferはエタ沈で除いているのでしょうか？ 一応高塩濃度のバッファーなので、上からローディングバッファーを加えているのであれば、マーカーの移動度とは多少ずれるかもしれません。 また、エタ沈後は、きちんとx1のローディングバッファーに溶かしているのでしょうか？手抜きでx6やx10のローディングバッファーに溶かすと、結構移動度がずれたりします。

投稿者です 削除/引用 No.633-11 - 2011/07/07 (木) 14:33:16 - kawashima エタ沈に関しては、100%エタノール、NaAc、グリコーゲンをそれぞれ250μl、10μl、1μl（全量100μlに対して)加え、遠心してペレットにして、上清を捨てて、ペレットを水に溶かしています。何か問題ありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.633-10 - 2011/07/07 (木) 14:20:06 - おお えたチンしてるんですね。ウォッシュで塩がうまく抜けてなかったってことはないでしょうか?

投稿者です。 削除/引用 No.633-8 - 2011/07/07 (木) 13:19:27 - kawashima 制限酵素処理はover nightでしているので、十分だと思うのですが…。 もしも制限酵素処理が終わった時点で少量流した時にはバンドの下端の高さは合っている(6kb)けれども、引き続き残り全量(大量)をエタ沈して一つのウェルに流した時にはバンドの下端が7kbに出てしまったとすれば、一つのウェルに大量に流したことが原因と考えるしかないのでしょうか？ ちなみに、今回はサブクロのために、3〜5μｇのplasmidを、plasmidが１μｇに対して制限酵素を１μlの割合で加え、totalで100μlになるスケールで制限酵素処理しています。(下記) plasmid : 3〜5μg H buffer: 10μl EcoR1 : plasmidが１μgに対して1μl DDW : (total１００μlになるように入れる) Total : 100μl

(無題) 削除/引用 No.633-7 - 2011/07/07 (木) 10:08:00 - ~ >なんとなく気持ち悪くて、そのバンドを回収できないでいます。 一晩たったゲルから切り出すより、切りなおしたほうが気持ちいいと思います。 その際に、制限酵素処理が終わったと考えたタイミングで、少量を流してサイズを確認してはいかがでしょうか。 そこで切断が不十分だと判断されれば、処理時間の延長や酵素の追加を考えられますし。

(無題) 削除/引用 No.633-6 - 2011/07/07 (木) 09:56:27 - おお >なんとなく気持ち悪くて、そのバンドを回収できないでいます。 回収して'一部をチェックに回すでしょうからその時確認それば? あまりにも量が違う物を比較するとバンドのすその方まで見えるので大きくなってるように見えてるのかモヨ。

投稿者です。 削除/引用 No.633-5 - 2011/07/07 (木) 09:38:20 - kawashima 制限酵素処理後はエタ沈をして、ゲルに流しています。 なので皆さんがおっしゃるような、塩濃度や制限酵素が絡まるなどの件は問題ないような気がするのですが・・・ どうみてもバンドの下端が1kbほど高い位置にあります。 (もちろん、大量にのせてしまったのでバンド自体も太いですが) 調べてみてもわかりません。 なんとなく気持ち悪くて、そのバンドを回収できないでいます。 理由はわからないでしょうか・・・

(無題) 削除/引用 No.633-4 - 2011/07/07 (木) 09:11:43 - kodamataro DyeはSDSが添加されているものでしょうか。 制限酵素処理後、カラム精製をしていないのでしたら 制限酵素がDNAに絡まって泳動距離が変わっている可能性があるかもしれません。 市販品でしたら ニッポンジーン社の313-90111が、SDSが入っています。

(無題) 削除/引用 No.633-3 - 2011/07/07 (木) 04:43:05 - 310 高い塩濃度のDNA溶液とマーカーを一緒に流すと、多少ずれますが1kbもずれるかは分かりません。 DNAをたくさん入れすぎると、サイズが変わる前にブロードになったり、尾をひいたりしますので、正確な分子量は分かりにくいと思います。

(無題) 削除/引用 No.633-2 - 2011/07/07 (木) 02:10:42 - のり 自分は経験ないですね 他のレーンに少ない量アプライして泳動して比べたらすぐにわかりそうですが

DNAの電気泳動について 削除/引用 No.633-1 - 2011/07/06 (水) 22:36:54 - kawashima アガロースゲル(エチブロ添加済み)にDNAを流す場合、 一つのウェルにアプライするDNAの量が多すぎると、泳導距離が大幅に変わったりするのでしょうか？ 具体的には、サブクロをしようと思った時のことで、 プラスミドを制限酵素で切ってゲルに流して回収しようとした時のことです。 ゲルに流した時に、6kbに一本バンドが出るはずが、どう見ても6kbではなく7kbあたりにバンドが出ています。(もちろん6kbには出ていません。7kbのみです。0.5%ゲルで十分な時間流して確認しています。) いろいろ考えたのですが、原因がわかりません。 大量のプラスミドを切って一気に同じウェルに流したので、大量のDNAを乗せすぎたために泳導距離が変わってしまったのかな、と考えていますが、わかりません。(というか、他に思いつきません。) ご存知の方いらっしゃいましたら、ご教授お願いいたします。

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