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(無題) 削除/引用 No.632-9 - 2011/07/10 (日) 10:28:41 - AP >310さんの紹介された文献だと、incubation time=0minとなっていても 低温にしていないだけで、室温ではincubateしているようですが、 そうは書いていないと思いますが。その実験例では室温のEtOHを加えて、即遠心していると読めます。 塩としてNH4OAcを使用した例ですが、合わせてFocus vol.9-2もご覧ください。 vol 7にも同様の結果が出ていましたが、DNA濃度が十分に高い場合は（5 ug/mL すなわち5 ng/uLというかなりの低濃度まで）、事前のインキュベーションをしてもほとんど回収率は向上しません。また、氷点下でのインキュベーションは逆に回収率を下げます（低温で粘性が上がり沈殿を妨げるためだろうと言っています）。それと、これらの結果は遠心を室温でやったものです。上記の条件なら室温で遠心してもおよそ９割以上の回収率があるということですね。 以上の結果を踏まえて、Gibco/BRL（Focusを出していた）はカタログのAppendixや実験ガイドに、DNAが0.1 ug/mL以上あれば、事前のインキュベーションなしで室温で遠心すればよい、10 ng/mL以下の場合は、室温でのO/Nインキュベーションをして遠心を30分に延長するのが良いと述べていました。 Molecular Cloningには、「つい数年前までは、ドライアイスエタノールなどでインキュベートするのがならいだったが、いまでは不必要であると認識されている（DNA濃度が20 ng/mL以上なら）」ということが書かれています。この記述、第３版にそのまま引き継がれていますが、じつは89年発行の第２版にすでに載っていました。すなわちFocus 7のでた85年ころ、四半世紀も前からということになります。ただし、Molecular Cloningでは、氷温での15-30 minのインキュベーションを勧めています。しかし、Focusをはじめ、多くの実験書、キットの説明書の記述を見る限り、その効果は疑問です。

(無題) 削除/引用 No.632-8 - 2011/07/10 (日) 01:42:20 - おお >[Re:7] エッタさんは書きました : > >310さん > なるほど。いままで冷やしてたので、勉強になりました。 > > >おおさん > 310さんの紹介された文献だと、incubation time=0minとなっていても > 低温にしていないだけで、室温ではincubateしているようですが、 > エタノール入れてすぐに遠心はじめちゃってもいいものなんでしょうかね。 マイクロチューブで100ng以上ある限りは大丈夫だと思います。マイクログラムオーダーになってくるとエタノールを加えた瞬間濁っているのが目視できます。すぐに遠心してもまずは大丈夫です。 直ぐに遠心すると沈殿が未発達でチューブのそこでなく壁に蓄積するという話も聞いたことがありますが、それはリカバリーの時のボリュームとかにもよるかもしれませんし70%エタノールで洗う時ボルテックスでけんだくすると言うのもできる場合があります。

(無題) 削除/引用 No.632-7 - 2011/07/09 (土) 00:03:43 - エッタ >310さん なるほど。いままで冷やしてたので、勉強になりました。 >おおさん 310さんの紹介された文献だと、incubation time=0minとなっていても 低温にしていないだけで、室温ではincubateしているようですが、 エタノール入れてすぐに遠心はじめちゃってもいいものなんでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.632-6 - 2011/07/07 (木) 05:23:59 - おお 冷却遠心機使っていたら遠心の時冷えてるじゃん長めにやったらって思ったこともありますね。 ただナノグラム単位であれば冷やさなくともしゅう率はほとんど変わらないと思って良いと思います(操作上のミスがない限り)。

(無題) 削除/引用 No.632-5 - 2011/07/07 (木) 04:58:02 - 310 冷やす時間があれば、その分遠心した方が良いとのデータがFocus(1985)Vol.7No.4に出ています。特にngオーダーの場合30分と言う長時間遠心で数割回収率が上がるようです。

(無題) 削除/引用 No.632-4 - 2011/07/06 (水) 23:47:19 - おお >制限酵素で切ったDNAの断端は無事なのでしょうか？ 無事だと思います。余程特別なことでないかぎり。とにかくアルコールを加えるまで作業をすればそこで一区切りできると言うのがプラスミドなどを扱うときの感覚です。

投稿者です。 削除/引用 No.632-3 - 2011/07/06 (水) 22:47:16 - 加地 >APさん 返信ありがとうございます。 では、かなり時間がたっていても、遠心してsubcloningに使ってしまっても大丈夫という理解でよろしいのでしょうか？制限酵素で切ったDNAの断端は無事なのでしょうか？ 細かい話で大変申し訳ありません。 また、フリーザーで冷やすというのが迷信のようなものだというのは、目からウロコでした。プロトコールが古いようです。自分でも最新のものを読んでみます。

(無題) 削除/引用 No.632-2 - 2011/07/06 (水) 22:30:04 - AP >遠心せずに-20℃に入れっぱなしにしておくと、どのくらいの期間もつのでしょうか？ まあ、半永久的にもつでしょう。 >普通はこの後、-20℃などで良く冷やしてから遠心・・という行程に入ると思うのですが、 遠心の前にフリーザーで冷やすというのは、むかしむかしには常識的でしたが、今は（すくなくとも通常あつかう位の極端に低濃度ではなく、オリゴのように極端にサイズが小さくなければ）やってもやらなくても変わらない、迷信のようなものというのが一般的な理解だとおもいます。参考書か、研究室のプロトコールが古いんじゃないでしょうか。

制限酵素処理後のエタ沈 削除/引用 No.632-1 - 2011/07/06 (水) 22:17:47 - 加地 plasmidの制限酵素処理後、エタ沈しようと思い、 100%エタノール、NaAc、Glycogenを入れました。 普通はこの後、-20℃などで良く冷やしてから遠心・・という行程に入ると思うのですが、 遠心せずに-20℃に入れっぱなしにしておくと、どのくらいの期間もつのでしょうか？ 例えば1か月とかおいておいても、遠心してペレットにして、subcloning等に使えるのでしょうか？ 基本的だとは思いますが、宜しくお願いします。

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