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(無題) 削除/引用 No.631-20 - 2011/07/16 (土) 15:45:17 - aji 大腸菌のタンパク質を大腸菌で発現させているから機能を保っている可能性が高い、という前提があるのかと思います。 しかし、機能を持った状態で発現するために他のタンパク質が必要な場合には、大腸菌の株によってはそれを全く持ってなかったり、その発現量が少なすぎたりして、標的の過剰発現だけでは機能をもって過剰発現できないものもあります。 大腸菌が自身で作れない補欠分子族を外部から取り込んで初めて活性を持つ酵素も知られています。 機能が全く予想できていないなら、とても難しい実験だと思います。

(無題) 削除/引用 No.631-19 - 2011/07/13 (水) 18:06:59 - カイ 「可溶性タンパクでも活性がないことがある」に同意。 うまく活性を維持したまま発現させてこようと思ったら工夫が必要なたんぱく質もあります。 過剰発現させたからにはシークエンス等はわかっているのでしょうから、どのグループに属するタンパクなのかも想像できますよね。 つまり、このタンパクとしては機能未知だけど、たとえばGAPドメインを持っているとか。ATPaseドメインを持っているとか。なにかのタンパクに似ているとか。 ものによっては、金属を入れた培地で培養する、ATPを入れたlysisバッファーで溶かす（その場合は精製の過程でずーっと入れっぱなしにします）などの工夫が必要です。 一般的な話であれば、フォールデングを助けるタンパクを共発現させる（GroEなど）、温度を下げて培養、IPTGの濃度を下げる、など基本的にゆっくり発現させる条件にすると可溶性に持ってき易いです。 「可溶性のほうが活性がある可能性が高い」にも同意しますのでね。 まずはその辺に注意しながら、とりあえず活性を測ってみたらいいのでは。

(無題) 削除/引用 No.631-18 - 2011/07/13 (水) 18:03:58 - 関係無いけど 未知だから、考えられるアッセイを行なって とある活性があるかどうか調べるじゃないの？ だれも触媒活性だけって言ってないし。

(無題) 削除/引用 No.631-17 - 2011/07/12 (火) 20:35:29 - なでしこ組 > どれかに活性があれば、その活性があるということじゃないの？ そのどれかが分らないから未知なんでしょ。触媒活性だけが活性でもなし。

(無題) 削除/引用 No.631-16 - 2011/07/12 (火) 13:46:08 - は？ ＞「機能未知」の蛋白質の「活性を測る」っていうのがよくわからないんだがどういうふうにするの 。 いろいろな機能解析をしてみて、（酵素活性をはかるとか、キナーゼアッセイをしてみるとか） どれかに活性があれば、その活性があるということじゃないの？ どうして最初から、特定の活性をはかるって偏見があるの？

(無題) 削除/引用 No.631-15 - 2011/07/10 (日) 02:03:59 - おお 因みに細胞をほもげないずして、不溶画分にくるたんぱく質が活性を持っているというケースもありますよ。

(無題) 削除/引用 No.631-14 - 2011/07/10 (日) 01:57:59 - おお 生化学的に考慮する可溶性とは実験上扱いやすいかどうかと言うことで、活性はまた別問題だと思います。 そのたんぱく質、りこんびなんとでなく生理的に発現した状態で、ある可溶化条件で溶液中に存在し活性があるなら、りこんびなんともそのバッファーで解けている状態だと活性がある"かもしれない"とはいえます。 ちゃんと可溶化してあるたんぱく質でも結晶かすると構造がへテロでいい結晶ができないという場合があります。これはある意味(必ずしもそうではないが)色々なフォールディングパターンが溶液中に存在する可能せいがあり、間違ったフォールディングがメインならそのタンパクの活性はあまり期待できません。ただ1%が活性を持っていて、それで白黒だけをつけようというのであればあり得る実験だとはおもいます。

(無題) 削除/引用 No.631-13 - 2011/07/09 (土) 19:33:29 - 中年 「可溶性」と言っても、preparativeな実験で通常用いられる程度の超遠心では上清に来てしまうような微細なアグリゲーションが出来ている場合は、活性は期待できないでしょう。特に、「大部分が封入体を形成し、一部が可溶性タンパクとして得られ」たような場合には、その種のトラブルはよくあります。

例え話の方が分かりやすいのであれば 削除/引用 No.631-12 - 2011/07/09 (土) 00:17:28 - ~ Ｑ.始めて見る野菜を買いました。家に持ち帰って料理しました。野菜なので絶対に美味しいですか？料理しても不味いことはありますか？ に答えてみれば、状況の理解につながると思う。 もしかして、活性の測定法がない、またはとても手前なので、たんぱく質が得られてから数日 実験を止めてるんですかね。

(無題) 削除/引用 No.631-11 - 2011/07/08 (金) 22:18:24 - ABZO 「機能未知」の蛋白質の「活性を測る」っていうのがよくわからないんだがどういうふうにするの 。

(無題) 削除/引用 No.631-10 - 2011/07/08 (金) 19:07:42 - ンンノ そもそも、 >大腸菌の機能未知タンパク質を過剰発現させ、機能解析を行う こういう戦略なんですから、四の五の言ってないで信じて実験し てみるしかないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.631-9 - 2011/07/08 (金) 17:02:47 - う ＞溶性であっても、活性が無い場合は何が問題となっているのでしょうか？ 私が機能を調べたいタンパクは大腸菌のタンパクなので翻訳後修飾が問題にならないとしたら、他に何が原因なのか思いつきません。 大腸菌に作らせるということ自体が、ブラックボックスにゆだねるということ。 何が原因か、わかるかわからない では無く、 結果としてどういうタンパク質ができたのか。 それだけが真実でしかないです。 ＞ミスフォールドしていても可溶性になる場合があるんでしょうか？ あると思います。また、ちょっとした形の違いが活性に関わらないとも言い切れません。 四の五の言わずに、 活性があるのか無いのか、確かめるしかないのです。

(無題) 削除/引用 No.631-8 - 2011/07/08 (金) 16:34:44 - ~ 「大丈夫だよ。必ず活性はあるよ」といって欲しいのでしょうか？ 何か分からないたんぱく質溶液について、必ず活性があるなどとは誰も言わないと思いますが… そもそもどんなたんぱく質なのかも抽出方法も分かりませんし。 >菌体内で作られたタンパク質については可溶性なら正しくフォールディングしている、つまり活性ありと考えていたのでしょうが違うのでしょうか 「全ての菌体内で作られた可溶性たんぱく質は必ず活性を持つ」が成立するかという質問であれば、 菌体内で作られた可溶化されているが酵素活性を持たない酵素溶液は、 http://kenkyuu2.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2817 こちらの方が持っていたようです。 抽出後にトラブルがあったようですが、それでも前述の命題は否定されます。 >活性が無い場合は何が問題となっているのでしょうか？ そのたんぱく質が活性を持つために必要なものが不足しているのか、活性の測定方法が間違っている、などが上げられるでしょう。 不足しているものが立体構造、co factor、金属イオン、活性測定方法の間違い等の何なのかは、今出している情報からでは提案の仕様も無いと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.631-7 - 2011/07/08 (金) 15:27:19 - タテヤマ う様 可溶性であっても、活性が無い場合は何が問題となっているのでしょうか？ 私が機能を調べたいタンパクは大腸菌のタンパクなので翻訳後修飾が問題にならないとしたら、他に何が原因なのか思いつきません。 ~様 菌体内で作られたタンパク質については可溶性なら正しくフォールディングしている、つまり活性ありと考えていたのでしょうが違うのでしょうか（翻訳後修飾などが問題にならないタンパクの場合） ミスフォールドしていても可溶性になる場合があるんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.631-6 - 2011/07/08 (金) 09:14:30 - ~ >ゲルにアプライする時点、サンプルバッファーを入れて加熱した後は封入体は溶けきっています。 いや、そういう意味ではなく、 サンプルバッファーを入れて加熱した状態では、たんぱく質は溶けていても基本的には変性していますよね。 変性していれば、溶けていても活性はないでしょう。 つまり、たんぱく質が溶解しているという状態は、元の活性を保った状態であることを保証しません。 そのため、溶けているから活性がありますかと聞かれても、その情報からでは必ずしも活性があるとはいえません。

(無題) 削除/引用 No.631-5 - 2011/07/07 (木) 19:06:28 - う 可溶性であれば、活性がある可能性が封入体よりも「高い」というだけです。 可溶性であっても、活性が無いことは普通にあり得ます。 そもそもの認識として、 大腸菌で作ったタンパク質が活性を持っていることは「絶対ではない」 可溶性である場合は封入体よりも活性を持っている「可能性が高い」 結論として、活性を調べてみなければわからないということになります。

(無題) 削除/引用 No.631-4 - 2011/07/07 (木) 18:21:06 - タテヤマ ンンノ様 可溶性タンパクとして得られても活性がない場合もあるということでしょうか？ ミスフォールドしたタンパク質が沈殿し、封入体を形成、一部の正しく折りたたまれて活性を維持したタンパクが上清にきていると考えているのですが。 ミスフォールドしても上清にくる場合があるということでしょうか？ ~様 ゲルにアプライする時点、サンプルバッファーを入れて加熱した後は封入体は溶けきっています。 溶解性は依然扱っていた別のタンパク質の封入体と変わらないという印象です。

(無題) 削除/引用 No.631-3 - 2011/07/07 (木) 09:17:57 - ~ 変性と不溶化を混同していませんか？ SDS-PAGEをやったことはありませんか？ あれば、ゲルにアプライする時点でのたんぱく質はどういう状態で、溶解性はどうですか？

(無題) 削除/引用 No.631-2 - 2011/07/06 (水) 19:31:18 - ンンノ 測ってみないとわかりません。

可溶性タンパクとして得られれば活性を維持している？ 削除/引用 No.631-1 - 2011/07/06 (水) 19:24:06 - タテヤマ 大腸菌の機能未知タンパク質を過剰発現させ、機能解析を行う予定でいます。 目的タンパクを発現させたところ、大部分が封入体を形成し、一部が可溶性タンパクとして得られました。 この可溶性タンパクとして得られたものは、確実に活性があるのでしょうか？可溶性タンパクとして得られても、活性を維持していない場合もあるのでしょうか？ よろしくお願いします。

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