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ありがとうございます。 削除/引用 No.629-8 - 2011/07/07 (木) 00:00:06 - まさ 勉強になります。 そうですね。仰る通りだと思います。そのままライゲーションしたほうが良さそうですね。 ゲルで切り出し精製はやっています。プレート上にコロニーは16hで３〜５個程度しかできていませんでしたので、制限酵素の問題はクリアできているのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.629-7 - 2011/07/06 (水) 22:33:02 - AP >制限酵素消化したベクターをゲル切り出しで精製することを、もしやっていないのならやることを勧めます。 ああ、やってるんですね。

(無題) 削除/引用 No.629-6 - 2011/07/06 (水) 21:12:52 - AP インサートの両末端が異なり、ベクターが二重消化なのであれば、インサートのリン酸化とベクターの脱リン酸化はしないで、そのままligationするのが第一選択ではないでしょうか。この場合インサート同士はligationしないわけですし、うまくアニーリングしていないオリゴも含まれていることも勘案して、ベクターに対してインサート大過剰気味に投入することで、目的のものが取れやすくなるでしょう。 >目的のものが得られません。セルフだと思われます。 セルフライゲーションが主要な問題ではないと思います。二重消化、かつ脱リン酸化しているのに、空のベクターばかり取れてくるのは、全く制限酵素で切れていない、切れ残りが混じっている可能性が高いです。alkali lysisで精製したプラスミドは部分変性して制限酵素で全く切れなくなったものが多かれ少なかれ混入してきます。少量でも混入するとそれはインタクトのプラスミドと同じくらい効率よく形質転換を起こしますので、空のプラスミドをもったコロニーばかりが取れてくるといことが起こりえます。 制限酵素消化したベクターをゲル切り出しで精製することを、もしやっていないのならやることを勧めます。

ありがとうございます。 削除/引用 No.629-4 - 2011/07/06 (水) 19:41:41 - まさ お二方、素早いご回答ありがとうございました。 ますはオリゴをリン酸化してやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.629-3 - 2011/07/06 (水) 19:01:45 - Oh >インサートは、アニーリングしたものをそのまま使用していますが、リン酸化は必要でしょうか？ Of course.

(無題) 削除/引用 No.629-2 - 2011/07/06 (水) 19:00:21 - おお ベクターを脱燐酸化した場合は、オリゴの燐酸化が必要です。 ベクターを脱燐酸かせずにオリごを過剰量1:~100ほりこんでクローニングする人もいます。大量入れることでセルフライゲーションがブロックされます。オリごは燐酸かされていない限りセルフでライゲーションされず、大量に入れてもタンデムリピートはできないです。 もしアニーリングを確認したいならポリアクリルあみどでそのレンジが見れるような電気えいどうをしてください。ただしアニーリングがパーフェクトでなくても(5%ぐらいしかただしいアニーリングしてなくても)クローンはちゃんと拾えるだろうとはおもいます。 どうしてもだめならプラスミドをその30マーのタグをつけたプライマーで増幅してセルフライゲーションしてつくるという手はあります。この時プライマーの末端は燐酸化してないのでどこかで燐酸かが必要になってきます(プライマーの末端がある制限酵素で切れるように仕組むとその必要はありません)。

ライゲーション 削除/引用 No.629-1 - 2011/07/06 (水) 18:11:12 - まさ 30merのオリゴDNAをアニーリングし、ベクターにライゲーションを行っているのですが目的のものが得られません。セルフだと思われます。いくつか疑問点があるのでお答えいただければと思います。 オリゴDNAは両端に異なる制限酵素サイト(突出末端)を持つように設計してあります。 またアニーリングは、95℃で15min反応させ、60minかけて30℃に温度を低下させています。 アニーリングバッファーの組成は、10mM Tris, pH 7.5, 50mM NaCl, 1mM EDTAで自作したものを使用しています。 アニールできているのか、アガロースゲル(50bp程度の差は判別できる)で電気泳動したのですが、アニーリングしたものとオリゴDNAを混合しただけのものでは差が見られませんでした。 これはアニーリングがうまくいっていないと考えた方が良いのでしょうか？ またベクターは、オリゴDNAの両端の制限酵素サイトでCUTし、電気泳動→ゲル抽出→精製→脱リン→精製をしています。 インサートは、アニーリングしたものをそのまま使用していますが、リン酸化は必要でしょうか？ ベクター：インサートはモル比を1:3でライゲーションを行っています。 よろしくお願い致します。

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