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(無題) 削除/引用 No.625-8 - 2011/07/10 (日) 19:02:19 - ABZO この蛋白質のユビキチン化をするE3は分かってるのかな？もしそうならそのE3とE1, E2とかATPとか必要ならE4とかも入れてin vitroでユビキチン化反応やって、ユビキチン化ーこの蛋白質を作って、それでアフィ二ティカラム作って細胞のライゼート流してくっついたやつを集めてくる。また一方でコントロールとして、なんか適当な他のユビキチン化蛋白質のアフィニティーカラム、調べてる蛋白質（ユビキチン化なし）のアフィニティーカラムも作って同じような事をする。３つのカラムからの溶出物を比較して上記１番目のアフィニティカラムの溶出物にのみ見られる蛋白質を同定する。現実的には関係ない蛋白質の方が圧倒的に多くて普通にゲルを目で見てもなんだか分からないかもしれない。だから、SILAC法とかみたいな定量的プロテオミクスの援用も視野にいれて実験をデザインするといいとおもう。

(無題) 削除/引用 No.625-7 - 2011/07/09 (土) 13:02:29 - おお ちょっと前に思いついたことがあったのですが、そのまま忘れてしまってました。イースト2ハイブリッドをつかう系でネガティブセレクションができますのでちょっとウルトラC的な気もしますがやれそうなことはありそうです。 まずイースト内でそのタンパクがADまたはBDと融合させた状態でユビキチン化しない環境をエスタブリッシュします。もしイーストのタンパクでなければE3ライゲースなど特異的なものがなくユビキチン化しないかもしれませんし、ユビキチン化されるサイトを潰したミュータントを作らないといけないかもしれません。この状態で、ライブラリーをスクリーニングします。マーカーをuraでおこない5ーFOAでセレクションします。uraポジティブの細胞は5ーFOAで死にますので、ユビキチンなしで結合するたんぱく質はおちてきます。その後イーストからライブラリーをえると、直接相互作用する遺伝子が落ちたらいぶらりーが取れるはずです。 ライブラリーをどのようにリカバーするかはなんとうりか方法があると思いますが、PCRで取ってくる方法も考えられます。ユビキチン化にE3ライゲーすなどが必要な時は、そのイーストに有効なE3ライゲーすをトランスフェクションし今度は違うマーカでポジティブセレクションすれば良いですね。またはユビキチン化部位を潰したミュータントを使ったのであればしくろへきさみど耐性株とCYHS2の組み合わせでキックアウト(ブラすみどを脱落)してから、ユビキチン化する物が入ったプラスミドを再度入れ直してスクリーニングが理論的にはできます。

(無題) 削除/引用 No.625-6 - 2011/07/09 (土) 05:50:44 - Boston-Pullman ユビキチン化部位がつぶれた変異体と比較解析（IP　→　MS）。

ありがとうございます。 削除/引用 No.625-5 - 2011/07/08 (金) 23:14:07 - Colorful 返信が遅くなって申し訳ございません。 回答ありがとうございます。 色々と試せることがあるなぁと勉強になりました。 > ~様 標的タンパク質に対する新規結合タンパク質を同定したいのですが、標的タンパク質の活性にユビキチン化が重要で、スクリーニングの時点で「ユビキチン化されている状態の標的タンパク質にのみ特異的に結合する」というselectionをかけられないか、と思った次第です。 ユビキチン化自体の有無はプルダウン→泳動で確認します。 Yeast Two Hybridを用いるなら、あまり酵母内で何度もselectionはかけたくないので、なんらかの条件を加えてライブラリーを作製すれば、拾いやすくなるかもしれません。 >おお様 やはりスクリーニング後にサイトを潰すなりしてselectionを掛けなおすというやり方が素直でしょうか。 最初MSで同定しようかと考えたのですが、精製に手間取りそうでまだgoサインは出ておりません。 アフィニテーでも取ってこられるのですね。クロマトは使ったことがないのでちょっと調べてみます。 > qq様 > というか、ユビキチンに直接結合してはダメなのですね？ ユビキチンに直接結合しても問題はないです。ただ、標的タンパク質特異的である必要があるので、K63ユビキチンに結合する分子ではなく、K63ユビキチンが付加されている状態の標的タンパク質に直接、あるいはユビキチンを介してinteractする分子であれば良いと思っております。

(無題) 削除/引用 No.625-4 - 2011/07/06 (水) 14:56:38 - qq >つまりユビキチン化されているタンパク質に結合するタンパク質を同定する方法です。 ユビキチンに結合するタンパク質を同定する訳ではないのですね。 というか、ユビキチンに直接結合してはダメなのですね？

(無題) 削除/引用 No.625-3 - 2011/07/06 (水) 13:53:34 - おお >[Re:1] Colorfulさんは書きました : > Yeast Two Hybridというシステムでは、ノーマルな状態の分子にしか効きませんよね？ > どなたか御回答お願いいたします。 ユビキチンがライゲーションされれば3ハイブリッドのようにワークする可能性がありますが、2ハイブリッドで拾えてくるものをどのように区別、あるいはのぞくかというところでもうひと工夫必要ではないかと(ユビキチン化サイトをつぶしたユビキチン化しないタンパクを強発現させておいてそれに結合するものを細胞内で吸着してミュートとか言うのもできるかもしれませんよ)。力仕事でやってのけることもあり得る手法ですけども。なのでノーマルの状態(多分ユビキチンかしない状態を言ってるんだと思いますが)でしか効かないとはいえません。 りこんびなんとやin vitroなどの系でユビキチン化タンパクがそれなりの量作れるなら、それであふぃにてぃーというのがストレートだと思います。 またユビキチン化したそのタンパクをマイルドな状態(コンプレックスをたもったまま)精製することができれば、MSで同定も可能かとおもいます。 ユビキチン化後の結合となにかファンクしょなる(活性など)を結びつけてスクリーニングするというのも考えられるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.625-2 - 2011/07/06 (水) 09:41:28 - ~ スクリーニングのスタート地点は何なのでしょうか？ 標品が用意できるのであれば、SPRで結合能は測定できるでしょう。 ユビキチンの有無でそれぞれでプルダウンして、2D-PAGEでディファレンシャルディスプレイをしても見つけられるかもしれません。 Yeast Two Hybridで取れた株を全て拾い、ユビキチン化の役者を潰してK63ユビキチン化を起きなくした株で再度Y2Hを行なって、生えてこないものをネガティブスクリーニングすることも出来るかもしれません。 （1次スクリーニングでユビキチン化しやすい条件が作れれば、より拾いやすくなるかも）

適切なスクリーニング法は？ 削除/引用 No.625-1 - 2011/07/06 (水) 04:15:35 - Colorful あるタンパク質に対して、ノーマルな状態には結合しないが、ユビキチン化（K63-type）されたときに結合するタンパク質を探索するには、どのようなスクリーニング方法がありますか？ つまりユビキチン化されているタンパク質に結合するタンパク質を同定する方法です。 Yeast Two Hybridというシステムでは、ノーマルな状態の分子にしか効きませんよね？ どなたか御回答お願いいたします。

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