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ウイルス　プラークアッセイに使用するゲル トピック削除
No.618-TOPIC - 2011/07/04 (月) 12:26:32 - ウイルス初心者

インフルエンザウイルスのプラークアッセイのプロトコールを検討しているのですが、ゲルが原因でうまくいきません。（トリプシンを阻害しているのではないかと考えています。）

研究室にあった
Lonza 社の SeaKEem GTG Agarose
Nacalai tesque 社の Agar Purified, powder
を使用してみましたが、プラーク自体が形成されません。

どの会社のアガロースが良いなどのアドバイスをいただければ幸いです。

よろしくお願いします。
　
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No.618-8 - 2011/07/05 (火) 12:35:53 - ウイルス初心者

in situ さん

ありがとうございます。

温度等も検討してみたいと思います。

染色液はナフトールブルーブラックを使用しています。

(無題) 削除/引用
No.618-7 - 2011/07/05 (火) 11:08:06 - in situ
吸着の方法、メディウムは特に問題なさそうですね。
メディウムはMEM+BSAを使うことが多いですが、そこはクリティカルではなさそうです。

染色はクリスタルバイオレットでしょうか？

実験室株じゃない株（新型とか）を使っている場合、培養温度を37℃ではなく、35℃に下げることが有効なこともあります。

参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用
No.618-6 - 2011/07/04 (月) 17:03:45 - ウイルス初心者

in situ さん

ありがとうございます。

他のアガロースを試してみようと思っていますので、
SeaPlaque 参考にさせていただきます。


メディウムはウイルスを希釈する時や、吸着させる時は
MEM/0.5%ペニシリンストレプトマイシンを使用しています。

ゲルと混ぜるメディウムは 10/7倍MEM/0.5%ペニシリンストレプトマイシンです。

吸着方法は、細胞をMEM/0.5%ペニシリンストレプトマイシンで2回洗浄した後、ウイルス液を100μLアプライし、37℃で30分間反応させています。乾燥しないように10分ごとに攪拌しています。
30分後にサンプルを取り除き、ゲルをのせています。

(無題) 削除/引用
No.618-5 - 2011/07/04 (月) 16:46:02 - in situ
インフルエンザウイルスの株によってはプラークを形成しにくいものがあり、SeaPlaqueアガロース（同じLonza社のもの）を使うことで改善することがあります。

温度はそのくらいで問題ないと思います。

ウイルス吸着の方法、使っているメディウムの組成などをもう少し詳しく書いてもらえると問題点を指摘できるかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.618-4 - 2011/07/04 (月) 16:28:25 - ウイルス初心者
in situ さん、おお　さん

ありがとうございます。


アガロースを原因と思う理由は、
アガロースゲルをのせた時にウイルスの感染が起こらなくなってしまうからです。
ゲルをのせるものと同一の方法で、ゲルをのせずにメディウムで培養した場合は、ウイルスの感染が起こります。

アガロースは 45 ℃に保持していて、37 ℃に保持していたメディウム及びトリプシンを 6 mL:14 mL:20 μL の割合で使用直前に混ぜ作製したものを、直ぐに細胞に乗せています。

(無題) 削除/引用
No.618-3 - 2011/07/04 (月) 16:13:06 - おお
わたしもなぜアガロース/アガーが原因と思われるのかききたかったのですが、そこが原因じゃあ無さそうですね。

(無題) 削除/引用
No.618-2 - 2011/07/04 (月) 13:21:13 - in situ
いきなりアガロースが原因と決めつけるのは何か根拠があるのでしょうか？

とりあえず、通常

Lonza 社の SeaKem GTG Agarose

を使っていますが、問題なくプラークは形成されています。

アガーを乗せるときの温度が高すぎたりしていませんか？

ウイルス　プラークアッセイに使用するゲル 削除/引用
No.618-1 - 2011/07/04 (月) 12:26:32 - ウイルス初心者

インフルエンザウイルスのプラークアッセイのプロトコールを検討しているのですが、ゲルが原因でうまくいきません。（トリプシンを阻害しているのではないかと考えています。）

研究室にあった
Lonza 社の SeaKEem GTG Agarose
Nacalai tesque 社の Agar Purified, powder
を使用してみましたが、プラーク自体が形成されません。

どの会社のアガロースが良いなどのアドバイスをいただければ幸いです。

よろしくお願いします。
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