>[Re:1] ひとりもんさんは書きました :
> お世話になっております。
>
> 抗腫瘍薬のin vivoでの効果を確かめるためにXenograft modelを使用しています。マウスに腫瘍を植え付け投薬し、治療が終了したら腫瘍を取り出し免疫染色などで評価します。
>
> この取り出した腫瘍から蛋白を抽出しウエスタンブロットを行いたいのですが、論文等で色々探していますがどうもピンとくるものがありません。みなさんどのような方法でされていますか？具体的に教えていただければ幸いです。
>
> ちなみに私はキアゲンのAllprep DNA/RNA/Protein kitというものを購入しましたが、やや操作が煩雑で蛋白定量がBCA法でしかできないと知り諦めかけています。もっと簡単にできればいいのですが。。。
RNAやDNAを取る必要がなければAllprep DNA/RNA/Protein kitを使う必要はないとおもいますが。。。
タンパクだと結局は腫瘍片をタンパク溶解用バッファーでけんだくして、うわずみを取れば良いので、そんな難しく考える必要はないと思いますが。。。
腫瘍片を摘出後細かくPBS中などでスライスして、遠心で回収してからバッファーにけんだくで大丈夫だと思いますが。組織片をくだくのにちょっと物理的に強い条件が必要かもしれませんが、比較的量が取れるならポリトロンやフレンチぷれすなども使えますが、ビートビーターやグラスビーズ、超音波なども使えると思います。
組織片をイソペンタンで急速凍結して免役組織よう保存サンプルをつくってから、クライオスタットで薄い断片をさくせいして、それをタンパク溶解バッファーに加えて抽出するというのも、免疫組織染色をよくやっている研究室ではやっています。薄い断片をつくるので、溶解で組織塊を残すことが少ないので、ホモげないずに手間を取らないと思います。
タンパク溶解バッファーはRIPAバッファーかサンプルバッファーを使ってみるのがいいかと思います(ほかのバッファーでもその特徴がいかせる場合は多々ありますが、具体的なイメージがないなら)。サンプルバッファーはDNAが溶出してくるためねんちょうな溶液になるかもしれませんが、その時はしりんじを使ってニードルを通してやるとある程度ほぐれます。サンプルバッファーは通常色素が入っているので色素抜きの物をつくらないとブラッドフォードなどのタンパク定量は難しいとおもいます。またSDSの濃度が高いのでブラッドフォードのときはじゅうぶん薄めた状態でタンパク定量をしないと測れないです。 |
|
このスレッドをはてなブックマークに追加