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(無題) 削除/引用 No.613-10 - 2011/07/19 (火) 05:18:16 - 310 bluehornet様のイソプロ沈とほぼ同条件で、DNA及びLPAキャリアを沈殿させました。沈殿は前回より小さく、70％エタノールで2回洗って、乾燥させるとほぼ見えなくなりました。これを12ulの10mMTris(pH8.5)で溶かしてアガロース泳動しました。電気泳動の結果はきれいでDNAは無事回収できました。DNA量から見ても、沈殿ステップで多量のDNAを失ったようには見えません。 しかしなんだかぶよぶよしたゲル状の不溶物がDNA溶液を吸い取った後に、チューブの底に残りました。DNAとは感じが違い、ポリアクリルアミドゲルの破片のようにも見えます。 これまで気がつかなかったので、今日LPAをDNA溶液と混ぜる前に酢酸ナトリウムと混ぜたのがいけなかったのでしょうか？それともLPAを作る時に、ミスをしてしまったかもしれません。下記のURLを参考に作り、一見きれいな粉末ができ、純水にも良く溶けたので成功したと思ったのですが...。 http://www.uvm.edu/~tpdelane/lab/protocols/LinearPolyAcryl.htm 何が起こったかお分かりの方いましたら、お教えください。

(無題) 削除/引用 No.613-9 - 2011/07/15 (金) 14:21:50 - bluehornet 310さん せっかくなので、No.613-5で得たサンプルをアガロース電気泳動（2%アガロース、TAE）してみました。イソプロ沈は4サンプル行っており、LPAを1ug/uL含むサンプルを計約80uL持っていたので、計4レーンにそれぞれ2.5uL、5uL、10uL、20uLアプライしてみました。 どのレーンでもBPBは順調にゲル内に泳動され50b.p.のバンドもゆがみなく確認できましたので、310さんの実験で泳動が乱れた原因はLPAではない可能性が高いと思います。 参考にしていただけたらと思います。

(無題) 削除/引用 No.613-8 - 2011/07/15 (金) 13:18:10 - bluehornet 310さん ペレットの形状は長径2mm位のペロッとした薄べったい楕円形だと記憶しています（チューブは2mlの丸底です）。 ただ、DNA量が少ない場合やlinear polyacrylamide（以後LPAと書きます）のみの場合、イソプロ沈直後はペレットはほとんど見えず、上清を除いた時に透明なものがチューブの底やや側方にへばりついているのが確認できます。70%エタノールを加えると、もちろん白いペレットとして確認できます。 僕は20ugのLPAを使っていますが、これは原報（Gaillard, C. and Strauss, F. (1990) Nucleic Acids Res. 18, 378）での上限になっています。原報では条件の詳細は不明ですが、10-20ugのLPAでエタ沈を行っており、20b.p.以上のpgオーダーのDNAをほぼロス無く回収し、PAGEをしています。 僕の場合の高い回収率は、イソプロ沈の効果と言うよりは十分量のLPAによるものかもしれません。 310さんのご健闘をお祈りしております。

(無題) 削除/引用 No.613-7 - 2011/07/15 (金) 10:22:40 - 310 bluehornet様 お教えいただき、ありがとうございます。イソプロ沈はアルコール体積比を少なく出来るので、液面からチューブの底までの距離を縮めることができますが、95%も回収できるとは思っておりませんでした。どうもMARMAIDの調子が悪いため、どこかのステップでイソプロ沈をさせていただきます。 ところで0.25% linear polyacrylamide 8 uLを単純計算すると20ugになりますが、沈殿の直径は数ミリくらいあったでしょうか？

何度もすみません 削除/引用 No.613-6 - 2011/07/14 (木) 13:00:49 - bluehornet 「3M酢酸ナトリウム 80uL」は「3M酢酸ナトリウム 40uL」の書き間違いです。

(無題) 削除/引用 No.613-5 - 2011/07/14 (木) 12:57:09 - bluehornet 打ち込み途中で、送信されてしまいました。暗証番号を入れておらず削除できなかったのでNo.613-4は無視して下さい。 310さん、もう解決されたかもしれませんが、参考までに。 手元に泳動用マーカー自作用の50 b.p. のPCR産物を持っていたので、僕がいつも行っているイソプロ沈条件で回収率の検討を行ってみました。 TEで4 ng/uLに調製したPCR産物の溶液400uLに0.25% linear polyacrylamide 8 uL、 3M酢酸ナトリウム 80uLを加えよく撹拌したのちイソプロパノール400 uLを加え、遠心（21900xg、10分、常温）でPCR産物を回収しました。回収したペレットを70%エタノールで洗浄後、遠心・回収・乾燥の後、20uLのTEで再溶解しました。回収率100%の場合は80ng/uLですが、今回、回収後のPCR産物の濃度は76 ng/uLだったので回収率95%となりました。 ながながと書きましたが、310さんの場合でもイソプロ沈で回収率90%以上は見込めるのではないかと思います。

mou 削除/引用 No.613-4 - 2011/07/14 (木) 12:22:55 - bluehornet

(無題) 削除/引用 No.613-3 - 2011/07/06 (水) 04:46:24 - 310 KY様 ありがとうございます。Wizardはミニプレップ用しか使ったことがありませんが、私が常用しているキアゲンとシステムは似ているような気がしました。どちらが回収率がいいかはキアゲンに聞くか、使って比較する必要があるでしょう。 >というか泳動するためにボリュームを下げたいだけであれば、単純にスピー >ドバック遠心濃縮装置などで液体を蒸発させて、20ulぐらいにしてから泳動 >すればいいような気はしますけど。どうなんでしょう。 スピードバックは壊れていますので、平常の濃縮は真空デシケーターで行います。プラトーになる前にPCR反応を終わらせる必要があるので、PCR産物の濃度は大変薄いです。しかし必要PCR産物量は1-3ugくらいあるため、濃縮前の溶液量は300ul-1.5mlと多めになります。これを脱塩せず濃縮するとサンプル間やマーカーとの塩濃度の差が大きくなり、泳動が歪むかもしれないと心配しており、エタ沈またはカラム精製を行っている次第です。

(無題) 削除/引用 No.613-2 - 2011/07/02 (土) 19:10:08 - KY 80bpぐらいのPCR産物ならゲル切り出し後にWizard SV Gel and PCR clean-up (Promega)で精製したことはあります。公式の情報としては80bpだと回収量は50％ぐらいらしい。 質問者さんはゲル切り出し前のようですが、一応そのWizard SVでもできるとは思いますが、他の方法と比べて効率はわかりません。 というか泳動するためにボリュームを下げたいだけであれば、単純にスピードバック遠心濃縮装置などで液体を蒸発させて、20ulぐらいにしてから泳動すればいいような気はしますけど。どうなんでしょう。

キャリア量とMgCl2エタ沈 削除/引用 No.613-1 - 2011/07/02 (土) 03:44:10 - 310 100bp以下のDNAを効率よく沈殿させる方法を探しています。アガロースゲル切り出し電気泳動前の濃縮なので、プライマーの残留は気にしません。JBC(1963 Vol238 No.9 p3053-3057)や生物工学（第89巻　第5号 p254-p256)で10mM Mgを使ったエタ沈が紹介されていました。0.3Mの酢酸ナトリウムと10mM　MgCl2にLPAキャリアを加えてエタ沈をしたのですが、この際キャリアの希釈を忘れてストック溶液を直接使ったため、数十ugのキャリアが沈殿しました。アガロース泳動をしたところ、BPBが中々ウエルから出ず、バンドの一部が乱れました。 自分では過剰なLPAが、DNAの泳動を妨げたと思っていますが、それで正しいでしょうか？私は数百ng-1ugくらいがLPAキャリアの適量と思っていましたが、その程度の量でも影響は低いものの、泳動を遅延させる効果があるのでしょうか？ また、MgCl2を低分子(20mer-100bp)DNAやマイクロRNAのエタ沈でお使いの方いましたら、回収率や注意点をお教えいただけないでしょうか？また、その他の方法で低分子核酸の沈殿、濃縮を行っている方いましたら、どのようにやっているか教えていただければ、幸いです。

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