ショ糖密度勾配遠心法によって、ラット組織（骨格筋）から細胞膜画分を分画したいのですが、うまくいきません。遠心後に勾配ができておらず、全て沈殿してしまっています。
現在行っている方法は、
1. 600 mgの組織を6 mLのバッファー（10 mM Tris, 0.25 M Sucrose, 5 mM sodium azide, leupeptin, pepstatin, PMSF, pH 7.4）に入れ、ポリトロンでホモジナイズ。
2. 遠心分離（1,000g, 10-min）。
3. 沈殿をポッター型ホモジナイザーで懸濁し、上清と合わせる。
4. 遠心分離（9,000g, 10-min）。
5. 上清をさらに遠心分離（190,000g, 60-min）。
6. 沈殿を懸濁する。
7. 5 mLの超遠心用チューブに、35%、30%、25%スクロース溶液（w/v）をそれぞれ1.4 mLずつ重層する。
8. 6の懸濁液（1 mL）をその上に重層する。
9. 遠心分離（190,000g, 16-hr）。
超遠心はスイング式を用い、加速と減速の強さは9段階の5に設定しております。
先行研究によると、細胞膜は25％層の上、低比重膜成分は35％の上に集まるらしいです。しかし、私がやると、遠心後は層ができておらず、サンプルは全て沈殿してしまいます。
懸濁が甘いのかと思い、ペッスルを使って念入りにやったつもりではありますが、改善されませんでした。
以上の方法で何か問題はありますでしょうか？
ご存じの方、よろしくお願いいたします。
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