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エタノール溶出脂質の分析 トピック削除
No.609-TOPIC - 2011/07/01 (金) 16:48:08 - そら
 いつも参考にさせていただいています。
 脂質分析&質量分析の初心者です。
 以下の点について、アドバイスいただけると幸いです。

 ある生体試料より、BD法にて総脂質を抽出し、100%エタノールに再溶解したあと、細胞に添加したところ、予想していた活性が認められました。100%エタノールに可溶性の脂質は低分子の脂質と考え、とくに脂肪酸やステロイド骨格を持つ脂質ではないかと予測しております(他のラボの先生にアドバイスいただきました)。
 そこで、このあと、LC−ESI-MSMS (liquid chromatography–electrospray
ionization–tandem mass spectrometry)にて解析しようと考えています。前段階のLCで分離条件として、脂肪酸を分離する系/ステロイド骨格をもつ脂質を分離する系に関するちょうどいい文献なり教科書なりがうまくヒットしません。移動層の条件や、カラムなどです。
 もしご経験がある方がいらっしゃいましたら、情報をいただけると大変たすかります。
 
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(無題) 削除/引用
No.609-10 - 2011/07/05 (火) 08:19:44 - そら
Kanataさん
〜さん

そうですね。概念的には”Lipidomics”に当てはまるように考えているのですが、アドバイスいただいた先生より、機器としてはLC-ESI-MSMSを進められたというところです。

問題点を明らかにしていただき、ありがとうございます。

まずはTLCで確認、そして、LCである程度、分画をとって、そのあとのステップに進むようにします。

(無題) 削除/引用
No.609-9 - 2011/07/04 (月) 15:30:29 - Kanata
~さん、
> >予想していた活性が認められました
> という結果が得られているのに、
> >包括的な脂質の解析が目的
> なのですか?

予想していた、というよりは期待していた、なのではないかと。
総脂質といえば相当数の脂質が存在するわけで、測定方法も変わってきます。質問者さんはLipidomicsをやろうとしているのかもしれませんが、
unbiasedでやるなら(機種によりますが)、LC-MS/MSは使わないはずです。
biasedでやるならどんな脂質が含まれているのかをまず知るべきで、それには古典的に、TLCで確認するのが良いかと思った次第です。おっしゃるようなさらなる分画がベストですね。

(無題) 削除/引用
No.609-8 - 2011/07/04 (月) 10:06:25 - ~
>予想していた活性が認められました
という結果が得られているのに、
>包括的な脂質の解析が目的
なのですか?

包括的に2サンプルの脂質を解析して、差のあるものを取ってくるのよりも、
LCや有機相抽出などで活性成分を分画して、そこを攻めるほうが効率がいいかもしれません。
(複数の成分が相加・相乗的に働いていると、分画を取るとどこにも活性がなくなることもありますが)

プロファイリングで攻めるのであれば、十分な数の生理活性のあるフラクションとないフラクションを用意しないと、2サンプルの濃度の差のデータから次の手が打てないかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.609-7 - 2011/07/04 (月) 08:41:14 - そら
kanataさま

> いただいたご質問、これは一緒に研究している方々とディスカッションする内容だと思います。
 ご指摘の通りです。共同研究者ではないため、突っ込んだディスカッションが出来ていないところが根本の問題だと再認識いたしました。

> 私は脂質を扱っていますが、低分子、高分子という区別の仕方は聞いたことがありません。その先生が好んで使われる、先生の中で定義されている意味での低分子ではないでしょうか。脂質の多くはエタノールに可溶します。それは低分子だからではありません。

 まさに、基本を(順序が逆ですが)勉強し始めました。

>  ですから、包括的な脂質の解析をするのか、特定の脂質の定量をするのか、決める必要がありますよね?まさか標準品を使わずに二つの異なるサンプルをMSで測定して比較することを考えていませんよね?内部標品を使って抽出効率などを決定しないと比較できません。MSの原理はご存知ですか?定量の経験は?

 包括的な脂質の解析が目的です。MSでの特定の物質の定量の経験は多少ですがありますが、その際は標品を抽出前よりもちろん添加して定量を行いました。今回は、これもアドバイスからなのですが、まずは2群間で比較を、ということでしたが、標品も準備し、かつTLCを行うべきですね。
                                   > 私でしたら1%より低い濃度で添加します。添加の仕方もいろいろあります。これだけでもトピック立てられる内容です。
 
 コントロール(エタノールのみ)は確認してありますが、このエタノールの濃度、添加の方法の”いろいろ”などは、どのように検索していくとヒットするのでしょうか。これまでの他の刺激物の経験で1%ぐらいまでなら大丈夫か、と選択したのですが。

 とにかく、もう一度基本的な事も含めて、再確認いたします。

 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.609-6 - 2011/07/04 (月) 03:59:13 - Kanata
そらさん、

いただいたご質問、これは一緒に研究している方々とディスカッションする内容だと思います。

> >低分子の定義は?脂質自体、ほとんどが”低分子”なわけですが。
>  BDにて抽出後、クロロホルムを飛ばして、エタノールに再溶解したところ、2層に分離したため、アドバイスいただいている先生に相談したところ、エタノールに可溶性の脂質は脂肪酸やステロイド骨格脂質などの”低分子”のため、このエタノール分画にて活性があれば、そのままLC-ESI/MSMSで解析するとどうでしょうか、と言われました。
>  この”エタノール可溶性の脂質”や、他の有機溶媒への脂質の溶解度などの基本的なことがまとまっている文献なりが、探し方がまずくどうにもヒットしません。

私は脂質を扱っていますが、低分子、高分子という区別の仕方は聞いたことがありません。その先生が好んで使われる、先生の中で定義されている意味での低分子ではないでしょうか。脂質の多くはエタノールに可溶します。それは低分子だからではありません。

 ですから、エタノール可溶性の脂質で検索しても情報は得られないでしょう。脂質の分類、基本事項に関しては生化学の教科書、また「脂質生物学がわかる」などの基本書に掲載されているので、目を通されてもいいかと思います。

> >目的は構造決定?定量?
>  同様のプロセスを経たコントロールの生体試料のエタノール分画の活性は低いため、これとの比較をまずしたいと考えています。

 ですから、包括的な脂質の解析をするのか、特定の脂質の定量をするのか、決める必要がありますよね?まさか標準品を使わずに二つの異なるサンプルをMSで測定して比較することを考えていませんよね?内部標品を使って抽出効率などを決定しないと比較できません。MSの原理はご存知ですか?定量の経験は?

>
> >その際にエタノール100%を最終濃度どれぐらいで細胞に添加したのか、添加の方法など気になりましたが、脇の話なので触れないことにします。
> 最終濃度1%で添加をしました。最終濃度と、細胞への影響、また添加の方法など、もしよろしければご教示ください。

私でしたら1%より低い濃度で添加します。添加の仕方もいろいろあります。これだけでもトピック立てられる内容です。
ところで、エタノールだけを添加した細胞を用意して、溶媒の影響を確認なさっていますよね?このコントロールを置くことが大事です。
>
>
> >TLCで挙動確認しましたか?
> 平行して行う予定です。

まずTLCで確認すべきでしょう。

私の装置ではないので構いませんが、このままエタノールサンプルを注入して測定すると、MSは汚れるし、カラム詰まって故障しますよ。
指導者の方と十分に実験計画を立てることを強くお勧めします。研究内容の詳細を知らない私にはこれ以上のアドバイスはできません。

(無題) 削除/引用
No.609-5 - 2011/07/02 (土) 20:49:44 - そら
kanataさん

ありがとうございます。

質問などをさせていただいてもよろしいでしょうか。まとまりのない質問で申し訳ありません。

>低分子の定義は?脂質自体、ほとんどが”低分子”なわけですが。
 BDにて抽出後、クロロホルムを飛ばして、エタノールに再溶解したところ、2層に分離したため、アドバイスいただいている先生に相談したところ、エタノールに可溶性の脂質は脂肪酸やステロイド骨格脂質などの”低分子”のため、このエタノール分画にて活性があれば、そのままLC-ESI/MSMSで解析するとどうでしょうか、と言われました。
 この”エタノール可溶性の脂質”や、他の有機溶媒への脂質の溶解度などの基本的なことがまとまっている文献なりが、探し方がまずくどうにもヒットしません。

>目的は構造決定?定量?
 同様のプロセスを経たコントロールの生体試料のエタノール分画の活性は低いため、これとの比較をまずしたいと考えています。

>その際に2層エタノール100%を最終濃度どれぐらいで細胞に添加したのか、添加の方法など気になりましたが、脇の話なので触れないことにします。
最終濃度1%で添加をしました。最終濃度と、細胞への影響、また添加の方法など、もしよろしければご教示ください。

>脂肪酸だとLC-MS/MS解析にはあまり向きませんが(感度低い)それでもLC-MS/MSで測定するのですか?
脂質だとAPPIも使えますが。ESIにこだわるのですか?
施設内で使用出来るもののなかで、アドバイスいただいたのが、LC-ESI-MSMSだったためです。ガスクロは、使用があまり出来ない状況です。

>TLCで挙動確認しましたか?
平行して行う予定です。

どんなことでもかまいませんので、アドバイスなどいただけますでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.609-4 - 2011/07/02 (土) 14:19:31 - Kanata
低分子の定義は?脂質自体、ほとんどが”低分子”なわけですが。
エタノール100%を最終濃度どれぐらいで細胞に添加したのか、添加の方法など気になりましたが、脇の話なので触れないことにします。

Pubmed引きました?
お探しのもの(具体的に何をイメージしているのかわかりませんが)関連の文献、たとえばステロイド骨格を持つ脂質の論文はごまんとありますよ。脂肪酸だとLC-MS/MS解析にはあまり向きませんが(感度低い)それでもLC-MS/MSで測定するのですか?
脂質だとAPPIも使えますが。ESIにこだわるのですか?
目的は構造決定?定量?
総脂質抽出しただけでさらに分離しないで測定するんですか?
TLCで挙動確認しましたか?
総脂質(混合物)を細胞添加して活性があったことに意義ってありますか?
BDだとかなり根こそぎとってきますが。

質量分析の問題ではなく、それ以前に検討すべきことがたくさんあるような気がします。

そうですね 削除/引用
No.609-3 - 2011/07/02 (土) 09:43:39 - そら
 そうですね、わかりました。もう少し自力でランをしてみて、再度相談させていただきます。

(無題) 削除/引用
No.609-2 - 2011/07/01 (金) 18:04:23 - ~
>ちょうどいい文献なり教科書なり
サンプルや、現時点での手持ちのアプリケーションや予備検討結果などの情報を出さないのに、
貴方の考えているちょうどいい情報がでてくると期待して待つのは時間がもったいないと思いますが。

メーカーの出しているアプリケーションでステロイドや脂肪酸を分離しているものはありますよね。
MS/MSも付いていますし、LC部分は既報に従ってやってみて、問題があるようであれば結果を見て対応してはいかがでしょうか。

エタノール溶出脂質の分析 削除/引用
No.609-1 - 2011/07/01 (金) 16:48:08 - そら
 いつも参考にさせていただいています。
 脂質分析&質量分析の初心者です。
 以下の点について、アドバイスいただけると幸いです。

 ある生体試料より、BD法にて総脂質を抽出し、100%エタノールに再溶解したあと、細胞に添加したところ、予想していた活性が認められました。100%エタノールに可溶性の脂質は低分子の脂質と考え、とくに脂肪酸やステロイド骨格を持つ脂質ではないかと予測しております(他のラボの先生にアドバイスいただきました)。
 そこで、このあと、LC−ESI-MSMS (liquid chromatography–electrospray
ionization–tandem mass spectrometry)にて解析しようと考えています。前段階のLCで分離条件として、脂肪酸を分離する系/ステロイド骨格をもつ脂質を分離する系に関するちょうどいい文献なり教科書なりがうまくヒットしません。移動層の条件や、カラムなどです。
 もしご経験がある方がいらっしゃいましたら、情報をいただけると大変たすかります。

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