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(無題) 削除/引用 No.604-4 - 2011/07/05 (火) 08:31:22 - Harmonia PCR で、プラスミド上の遺伝子が検出できる？ ＜有るか無いかぐらいは言える（断片化してても引っかかるけど) ゲノムとプラスミドのサイズ、プラスミドの対ゲノムコピー数は？ ＜泳動した量で、見えるか見えないかの判断ができる。（おおさんと同じ) 組換え大腸菌から導入したプラスミドを抽出した方法を試す ＜ゲノムは別途、とる必要あり。

(無題) 削除/引用 No.604-3 - 2011/07/02 (土) 15:01:02 - おお わたしなら、まず以下のように筋道を立てて考えます。 プラスミドの長さと扱うバクテリアのゲノムの長さをしらべます。ゲノムの長さがあまり研究されてないものであれば、近縁のものを参照します。それが分からなければ知られているバクテリアのゲノムサイズをある程度当たって平均どれくらいとか、最長でどれくらいというのをわりだします。 とにかくゲノムの長さがわかれば、プラスミドを検出するのに100ngくらいはいるだろうという前提(あるいはあなたの系での検出限界からすくなくても1オーダー高い数値)でその量のプラスミドを電気えいどうするのにトータルで何マイクログラムひつようか計算します(もちろんプラスミドのコピー数も考慮に入れて良いです、入れない場合は1コピーあれば検出できる量を見積もっているので、より安全な数字が出るでしょう)。 さて、電気えいどうできれいにながすなら10マイクログラム程度です。もう少し多く流せるかもしれませんが、きれいに流すには工夫もいるかもしれませんね。 ラフな見積で何とかみれますね。プラスミドにシングルカットをいれるとバンドがシャープになりますので見易いかもしれません。 非常に高分子のDNAを含んでますので、えいどうが乱れるかもしれませんのできれいに行くかはちょっと予測がつきません。

(無題) 削除/引用 No.604-2 - 2011/07/01 (金) 11:40:31 - ~ 操作は詳しく書かれていますが、材料が何か分かりませんので、どのような結果が妥当であるのかが分かりません。 １． >電気泳動をするとバンドが2本出ると思っていたのですが なぜ？ 材料が何か分からないので、何が妥当な結果なのかが分かりません。 プラスミドが1種類であっても、高次構造によっては複数のバンドとなる可能性もあります。 ２． >抽出したtotalにはプラスミドDNAも混じっているはず が前提条件であれば、少なくともゲル中にプラスミドDNAはアプライされます。 ただ、その前提条件が成立しているのかが分かりません。 >プラスミドのバンドも出るのでしょうか？ 泳動条件によってはプラスミドDNAが流れ切るかもしれませんし、検出限界以下で検出されないかもしれません。 そのため、でるかどうかは条件次第です。 そもそも、1本しか見えないバンドがゲノムDNAではなくプラスミドDNAである可能性は否定されるのでしょうか。 ３． >染色体、プラスミドが合わさって一本のバンドで出てしまうのでしょうか？ プラスミドのサイズや泳動条件によってはありうるでしょう。

電気泳動によるプラスミドの検出 削除/引用 No.604-1 - 2011/07/01 (金) 01:11:21 - プラス こんにちは。 初歩的な質問で申し訳ありませんが、教えていただけると助かります。 細菌から下記のような方法でtotal DNAを抽出しました。 プラスミドも下記方法で抽出され、電気泳動をするとバンドが2本出ると思っていたのですが1本しか出ません。 抽出したtotalにはプラスミドDNAも混じっているはずですが、これを0.9%のアガロースゲルで電気泳動した場合、染色体のバンドの他に、プラスミドのバンドも出るのでしょうか？ それとも染色体、プラスミドが合わさって一本のバンドで出てしまうのでしょうか？ 宜しくお願いします。 ＜total抽出＞ 1　TE bufferで菌体を懸濁 2　Lysozyme、achromopeptidaseを加え、ローテーターで10分間転倒混和 3　37°Cで1時間incubation 4　10% SDS、protainase Kを加えて15分間転倒混和 5　37°Cで1.5時間incubation 6　5 M NaClを110 μL加えて5分間転倒混和 7　CTAB/NaClを80 μL加えて15分間転倒混和 8　65°Cで20分間incubationした。 9　室温冷却後クロロホルムを加えて15分間転倒混和 10　遠心分離 (13,000 rpm、15分間、室温) 11　上層 (水層)を新しいマイクロチューブに移す 12　上層の0.7倍量の2-プロパノールを添加して15 min転倒混和 13　遠心分離 (13,000 rpm、10min、4°C) して、上清を取り除く 14　70% エタノールを400 μL加えてペレットをリンス 15　遠心分離(15,000 rpm、10 min、4°C)して、上清を取り除く 16　乾燥 17　TE bufferに溶解

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